双荧光素酶报告系统鉴定miR-204对水通道蛋白1基因的调控作用

作者：危敏^*; 余海浪; 蔡翠霞; 孟伟

来源：生物技术, 2019, 29(04): 324-329.

DOI：10.16519/j.cnki.1004-311x.2019.04.0055

• AQP1
• 3'-UTR
• miR-204
• K562细胞
• 双荧光素酶报告系统

[目的]构建水通道蛋白1(AQP1)基因3'-UTR双荧光素酶报告载体,并验证miR-204与AQP1基因的靶向调控关系。[方法]采用生物信息学软件预测miR-204与AQP1基因的结合位点;荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测转染miR-204抑制剂前后miR-204及AQP1在K562细胞中的表达改变;构建AQP1-3'UTR野生型及突变型重组质粒,与miR-204、阴性对照共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。[结果]转染miR-204抑制剂后,miR-204表达量较阴性对照及空白对照组明显下降,分别为1. 97、9. 32、11. 25(P <0. 01);而AQP1基因表达显著增高,分别为13. 14、2. 29、2. 54(P <0. 01);酶切及测序结果表明已成功构建psi CHECKTM-2-AQP1 3'-UTR野生型和突变型重组质粒。荧光素酶活性结果表明,miR-204可使野生型AQP1 3'-UTR质粒荧光素酶活性降低约65. 9%,而对突变型质粒荧光素酶活性没有显著影响。[结论]成功构建了AQP1基因3'-UTR的荧光素酶报告基因载体,miR-204对AQP1存在靶向调控。

• 单位
  基础医学院; 南方医科大学; 深圳市南山区妇幼保健院