结缔组织生长因子重组干扰载体慢病毒颗粒的构建及其对视网膜血管内皮细胞内源性结缔组织生长因子表达的抑制作用

作者：牛瑞; 东莉洁; 马腾; 杜雪利; 何燕华; 崔伟娜; 胡博杰^*

来源：中华眼底病杂志, 2018, 34(06): 580-585.

• 结缔组织生长因子
• 慢病毒感染
• 视网膜血管/细胞学
• 内皮细胞

目的构建结缔组织生长因子(CTGF)重组干扰载体(shRNA),观察其对视网膜血管内皮细胞内源性CTGF表达的抑制作用。方法构建人源CTGF shRNA,应用三质粒包装系统获得高滴度的CTGF shRNA慢病毒颗粒。感染视网膜血管内皮细胞,利用干扰载体中的红色荧光标记示踪并筛选慢病毒的最佳感染复数及起效时间。将细胞分为空白对照组(正常培养)、感染对照组(Scramble shRNA病毒感染)及CTGF敲低组(CTGF shRNA病毒感染)。通过Transwell细胞迁移实验观察3组细胞的迁移能力;实时定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测3组细胞的结缔组织生长因子(CTGF)、纤连蛋白(FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)的mRNA和蛋白表达。3组间数据比较采用方差分析。结果 CTGF shRNA的最佳感染复数为20,最佳起效时间是72 h。Transwell细胞迁移实验结果显示,CTGF敲低组穿过小孔细胞数较空白对照组及感染对照组明显降低,差异均有统计学意义(F=20.64,P=0.002)。实时定量PCR及Western blot检测结果显示,CTGF敲低组CTGF、FN、α-SMA、ColⅠmRNA(F=128.83、124.44、144.76、1 374.44,P=0.000、0.000、0.000、0.000)和蛋白表达(F=22.55、41.60、25.73、161.68,P=0.002、0.000、0.001、0.000)较空白对照组、感染对照组明显降低,差异均有统计学意义。结论成功构建的CTGF shRNA慢病毒颗粒可有效抑制视网膜血管内皮细胞迁移并下调内源性CTGF的表达。

• 单位
  天津医科大学; 天津医科大学眼科医院