摘要
目的探讨神经纤毛蛋白1(NRP-1)和血管内皮生长因子(VEGF)在多形性胶质母细胞瘤(GBM)复发和耐药性中的机制。方法体外培养人源性GBM1A和GBM22细胞株, 通过感染慢病毒shRNA的方式沉默VEGF或NRP-1。根据感染慢病毒shRNA的种类, 将两种细胞株分别分为shCont组(感染无义序列shRNA)、shNRP-1组(感染NRP-1慢病毒shRNA)及shVEGF组(感染VEGF慢病毒shRNA)。采用实时荧光定量聚合酶联链式反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹法检测肿瘤细胞株在沉默NRP-1或VEGF基因后干细胞标志物[包括:性别决定区Y盒2(Sox2)、表皮生长因子受体(EGFR)、N-钙黏附素(N-cadherin)、CD133、细胞间质上皮转换因子(c-Met)]的基因和蛋白表达情况。采用细胞划痕实验、Transwell小室测定法、神经球形成实验及MTT法检测肿瘤细胞的迁移能力、侵袭能力、神经球形成能力及细胞代谢活性。采用细胞生长抑制实验检测肿瘤细胞株在沉默VEGF或NRP-1后对替莫唑胺(TMZ)、紫杉醇(PTX)和卡博替尼(XL-184)的敏感性。向GBM1A和GBM22细胞株中的shCont组和shNRP-1组分别加入10 μg重组VEGF, 分为shCont组、shCont+VEGF组、shNRP-1组、shNRP-1+VEGF组, 判断NRP-1与VEGF之间的相互作用。结果 GBM1A细胞株中, shVEGF组和shNRP-1组Sox2、EGFR、N-cadherin, CD133及c-Met的mRNA含量均较shCont组下降(均P<0.05)。GBM1A细胞株中, shNRP-1组和shVEGF组EGFR、CD133、N-Cadherin的蛋白质相对表达量、24 h和48 h时的细胞划痕愈合率及发生细胞迁移的比例均较shCont组低(均P<0.05), 但shNRP-1组和shVEGF组间的差异均无统计学意义(均P>0.05);GBM22细胞株得到相似的结果。在GBM1A细胞株和GBM22细胞株中, 3组细胞活力的差异均无统计学意义(均P>0.05)。根据绘制的剂量-生长曲线, GBM1A细胞株中, shNRP-1组和shVEGF组TMZ、PTX、XL-184的半抑制浓度(IC50)均低于shCont组(均P<0.05);在GBM22细胞株得到相似的结果(均P<0.05)。GBM1A细胞株中, shCont组和shCont+VEGF组形成神经球的数量均高于shNRP-1组和shNRP-1+VEGF组(均P<0.05), 其中shCont+VEGF组高于shCont组(P<0.05), 而shNRP-1组和shNRP-1+VEGF组间的差异无统计学意义(P>0.05);GBM22细胞株得到相似的结果。结论沉默VEGF或NRP-1基因在不影响GBM本身活力的情况下可有效抑制其干细胞性, 降低其迁移能力及侵袭力, 并恢复其对化疗药物的敏感性;VEGF介导的细胞迁移可能依赖NRP-1发挥作用。
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单位基础医学院; 内蒙古医科大学附属医院; 内蒙古医科大学