微小隐孢子虫RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法的建立及应用

作者：王丽; 李珊; 李璐; 张西臣; 王晓岑; 李新; 张楠; 宫鹏涛

来源：中国畜牧兽医, 2023, 50(12): 4793-4804.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2023.12.002

• CRISPR/Cas12a
• 微小隐孢子虫
• 重组酶聚合酶扩增
• 可视化检测

【目的】建立一种快速、准确、灵敏的微小隐孢子虫可视化检测方法。【方法】本研究将重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)技术与CRISPR/Cas12a系统相结合，通过荧光检测法和侧流层析试纸条读取结果。针对微小隐孢子虫的小亚基核糖体RNA(small subunit ribosome RNA,SSU rRNA)基因设计和筛选crRNA和RPA引物，利用两种不同的单链DNA报告分子以荧光数值和侧流层析试纸条呈现检测结果。通过检测微小隐孢子虫和7个其他病原体评估RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的特异性。通过梯度稀释的重组质粒和微小隐孢子虫基因组评估RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的敏感性，并将该方法应用于临床样本的检测。【结果】本研究建立的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法可在90 min内完成对样本中微小隐孢子虫的检测，与大肠杆菌、十二指肠贾第虫、华支睾吸虫、弓形虫、肝片吸虫、人五毛滴虫、沙门菌均无交叉反应，可特异性检测出微小隐孢子虫；敏感性试验结果显示，该方法的最低检测限为10个卵囊/mL。利用此方法对70份牛粪便样本和50份人粪便样本进行检测，经荧光检测法和侧流层析试纸条读取结果，微小隐孢子虫的阳性率分别为15.7%(11/70)和6.0%(3/50),与套式PCR检测结果完全一致。【结论】本研究建立的微小隐孢子虫RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法具有高特异性和高灵敏度，且检测结果直观，不依赖昂贵的仪器设备，在微小隐孢子虫的现场检测和风险监测方面具有广阔的应用价值。

• 单位
  吉林大学