人呼吸道合胞病毒微型基因组拯救系统的建立及功能鉴定

作者：朱传凤^*; 韦钦钦; 白慕群; 王婉; 傅生芳; 马超^*; 高雪军

来源：中国生物制品学杂志, 2020, 33(06): 665-675.

DOI：10.13200/j.cnki.cjb.003077

• 人呼吸道合胞病毒
• 微型基因组
• 增强型绿色荧光蛋白

目的建立人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,hRSV)微型基因组拯救系统,并鉴定其功能。方法利用包含T7启动子、锤头状核酶、hRSV的前导序列、基因起始信号、非编码区、多克隆位点、基因终止信号、尾随序列、丁肝核酶、T7终止子的基本载体pRSV1和pRSV2,与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)基因构建微型基因组质粒pRSV1-eGFP和微型反基因组质粒pRSV2-eGFP。以pcDNA3. 1(+)为表达载体,与优化后的RSV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)、聚合酶大片段(L)和转录延长/终止抑制因子(M2-1)基因序列构建辅助质粒pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L和pcDNA-M2-1。将微型基因组质粒或微型反基因组质粒通过单转染、与RSV共感染或与辅助质粒共转染至表达T7 RNA聚合酶(T7 RNP)的BSR-T7/5细胞,荧光显微镜或流式细胞仪观察eGFP的表达,并鉴定微型基因组的功能及辅助蛋白的生物学活性。结果微型基因组质粒、微型反基因组质粒和4个辅助质粒经双酶切及测序证明构建正确;微型基因组质粒通过先感染后转染或与辅助质粒共转染,观察到eGFP的表达,证实了微型基因组的功能活性;缺乏N、P或L蛋白,检测不到eGFP的表达;缺乏M2-1蛋白,eGFP的表达量降低。结论成功建立了RSV微型基因组拯救系统,并证实了其拯救功能,为利用反向遗传学手段拯救重组RSV,研发RSV减毒活疫苗奠定了基础。

• 单位
  兰州生物制品研究所有限责任公司