柑橘大实蝇气味结合蛋白BminOBP6与其气味配体的互作机制

作者：杨岭; 田晓丽; 桂连友; 王福莲; 张国辉^*

来源：中国农业科学, 2023, 56(07): 1311-1321.

• 柑橘大实蝇
• 气味结合蛋白
• 同源建模
• C末端
• 原核表达
• 荧光竞争结合

【目的】通过构建柑橘大实蝇(Bactrocera minax)BminOBP6的C末端截短突变体(TOBP6)，比较野生型BminOBP6和突变体TOBP6对气味配体的结合能力，检测在不同pH条件下二者对气味配体结合能力的差异，为揭示BminOBP6与配体的互作机制提供参考。【方法】通过在线工具SWISS MODEL对BminOBP6进行同源建模，根据构建的3D模型确定将被切除的BminOBP6第6个α螺旋(α6)之后的C末端序列；设计特异性引物扩增BminOBP6的C末端截短突变体(TOBP6)的编码序列，即TOBP6；构建重组表达载体pET32a/TOBP6，将此重组载体与实验室保存的重组载体pET32a/BminOBP6分别转入原核细胞BL21(DE3)中，异源表达野生型BminOBP6及其突变体TOBP6；以1-NPN为荧光探针进行荧光竞争结合试验，检测BminOBP6和TOBP6在两种pH环境(pH 7.4和pH 5.0)下对1-十一醇和(+)-柠檬烯的结合能力。【结果】序列比对结果显示，BminOBP6与致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)CquiOBP1的序列具有很高的相似性，为62.6%，远高于30%，因此选择以CquiOBP1的3D结构作为BminOBP6同源建模模板。模型显示BminOBP6的α6之后是由8个氨基酸残基(D117—P124)组成的C末端序列，即将被切除的C末端序列。在此基础上设计引物克隆获得了编码TOBP6的cDNA序列，并构建了其重组表达载体pET32a/TOBP6，该重组载体和pET-32a/BminOBP6重组载体分别转入大肠杆菌细胞中进行了异源表达。荧光竞争结合试验结果显示，在pH为7.4时，BminOBP6与1-十一醇和(+)-柠檬烯具有很强的结合能力，Ki值分别为6.89和9.50μmol·L-1。当pH降至5.0时，BminOBP6却丧失了对1-十一醇的结合能力，同时与(+)-柠檬烯的结合能力也大幅减弱，Ki值从9.50μmol·L-1升至31.26μmol·L-1；而不论在何种pH条件下，TOBP6均丧失了对这两种气味配体的结合能力。【结论】pH在柑橘大实蝇BminOBP6与其配体结合和释放过程中发挥了重要作用，并且BminOBP6的C末端在配体的结合中起着关键作用。

• 单位
  长江大学; 生命科学学院