金黄色葡萄球菌处理对奶牛乳腺上皮细胞外泌体表征的影响

作者：蔡萌; 朱晓艳; 王梦玲; 刘子豪; 熊本海^*; 杨亮^*

来源：中国畜牧兽医, 2022, 49(08): 3091-3098.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2022.08.025

• 奶牛
• 金黄色葡萄球菌
• 乳腺上皮细胞
• 外泌体

【目的】本研究旨在从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus,以下简称金葡菌)处理奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cell, BMEC)上清中分离外泌体，探究金葡菌与BMEC数量比值(MOI)和处理后培养时间对外泌体总浓度的影响，并对金葡菌诱导BMEC释放的外泌体进行分离和鉴定。【方法】采用金葡菌临床分离菌株以MOI=1和MOI=10分别处理BMEC 3 h,对已处理的BMEC继续无外泌体培养9、12、24 h,同时设空白对照组，通过扫描电镜观察金葡菌处理对BMEC造成的超微结构损伤。采用超速离心法分离金葡菌诱导的BMEC上清液中的外泌体，分别用透射电镜、纳米颗粒追踪分析技术及Western blotting法对外泌体形态、颗粒大小和特异性标志蛋白进行分析鉴定。通过检测外泌体总蛋白浓度评估不同MOI和处理后培养时间对外泌体总量的影响，明确金葡菌诱导BMEC释放外泌体的最佳条件。【结果】通过扫描电镜观察发现，金葡菌处理BMEC后，细胞微绒毛脱落，细胞骨架破坏。透射电镜观察分离的外泌体为圆形的双层膜囊泡，直径在30～150 nm,形态均一。通过检测外泌体总蛋白浓度显示，在MOI=10时，培养9、12和24 h金葡菌诱导BMEC释放外泌体蛋白浓度均高于MOI=1,而培养12 h时释放外泌体蛋白浓度最高。对金葡菌诱导BMEC释放的外泌体进一步鉴定，其平均直径约为116 nm; Western blotting检测结果显示外泌体标记物CD9、CD81和TSG101表达阳性。【结论】本研究从形态学和分子生物学特征等方面证实获得的分离物为外泌体；金葡菌可以诱导BMEC释放外泌体，当MOI=10时，金葡菌处理细胞3 h后继续无外泌体培养12 h,收获的细胞上清中外泌体蛋白含量最高。

• 单位
  中国农业科学院北京畜牧兽医研究所; 动物营养学国家重点实验室