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摘要
目的制备抗刚地弓形虫前纤维蛋白(Tg PRF)的多克隆抗体,初步研究其对刚地弓形虫在小鼠胚胎成纤维细胞中增殖的影响。方法提取刚地弓形虫RH株RNA、扩增Tg PRF基因,并构建pET-30a (+)-Tg PRF重组质粒,将其转化至大肠埃希菌BL21 (DE3)感受态细胞,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定蛋白表达情况。目的蛋白经AKTA系统进行亲和层析纯化和超滤浓缩后进行蛋白质印迹分析(Western blotting)。将2 mg纯化的重组蛋白Tg PRF与等体积弗氏完全佐剂混合乳化后,背部皮下多点注射免疫新西兰兔2只,首次免疫后每隔2周,用1 mg纯化的重组蛋白Tg PRF与等体积弗氏不完全佐剂加强免疫3次,末次免疫后10 d心脏采血。免疫后血清进行Western blotting鉴定及ELISA抗体效价检测。将胚胎成纤维细胞接种于96孔板中(4×103个细胞/孔),并加入104个刚地弓形虫速殖子(RH-GFP)。设空白对照组(A组),抗体干预组(B1、 B2和B3组),阴性血清组(C组)。B1、 B2和B3组分别加入1∶20、 1∶80、 1∶200稀释的抗Tg PRF兔血清100μl; C组加入1∶20稀释的免疫前兔血清100μl,每组均设3个复孔。培养72 h后荧光显微镜观察,通过Image pro 6.0软件分析虫体增殖情况。采用SPSS13.0软件进行统计学分析。结果 PCR扩增Tg PRF基因片段为510 bp, pET-30a (+)-Tg PRF经测序与目的序列完全一致。经IPTG诱导表达,Tg PRF蛋白相对分子质量(Mr)约为25 000,且高表达条带主要存在于上清中。Tg PRF蛋白经纯化浓缩后浓度为4 mg/ml, Western blotting分析显示,在Mr25 000处出现特异性条带。经细胞计数试剂盒(CCK-8法)检测,抗Tg PRF血清对胚胎成纤维细胞未见毒性损伤。ELISA检测抗Tg PRF血清抗体效价> 1∶105;各实验组细胞于感染24 h时,A组(0.62±0.23)及C组(0.74±0.25)相对虫体数量高于B1组(0.35±0.16)(P <0.05),但与B2和B3组间差异无统计学意义(P> 0.05), B1～B3组虫体增殖抑制率分别为43.5%、 11.4%、 3.6%。感染48 h时,A组(3.61±0.66)与C组(3.38±0.78)相对虫体数量明显高于B1～B3组(P <0.01),而B1组(1.09±0.58)与B2组(1.92±0.73)低于B3组(2.47±0.84)(P <0.05), B1～B3组虫体增殖抑制率分别增高至69.9%、 46.9%、 31.7%;感染72 h时,A组(19.90±3.92)与C组(20.61±4.07)相对虫体数量高于B1组(5.58±2.43)与B2组(8.06±2.66)(P <0.01), B3组(16.02±6.46)明显升高。B1～B3组抑制率分别为72.0%、 59.5%、 19.5%。结论弓形虫Tg PRF蛋白能有效刺激新西兰兔产生抗体,且Tg PRF兔血清抗体在体外能有效抑制弓形虫速殖子在小鼠胚胎成纤维细胞中的增殖并呈现明显的量效关系,但并不能完全消除虫体。
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