Prkaa2对肾小管上皮细胞纤维化的调控作用及Prkaa2和Rps6ka1间的关系研究

作者：刘华建; 李雪艳; 范旭; 殷晓鸣; 赵琦; 刘鑫; 杨屹^*

来源：中华小儿外科杂志, 2022, 43(02): 157-163.

• 核糖体蛋白质S6激酶类
• AMP活化蛋白激酶
• 肾小管上皮细胞

目的探讨腺苷酸活化蛋白激酶亚基α2(protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 2, Prkaa2)与核糖体蛋白S6激酶A1 (ribosomal protein S6 kinase A1, Rps6ka1)的关系及Prkaa2对转化生长因子β1 (transforming growth factor-β, TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞纤维化的影响。方法用重组蛋白TGF-β1诱导NRK-52e细胞制备纤维化的细胞模型。采用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)、蛋白质印迹法检测大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52e细胞(对照组)和10 ng/ml TGF-β1诱导12、24、36 h的NRK-52e细胞中Prkaa2的表达水平。于NRK-52e贴壁生长达30%时加入Prkaa2低表达慢病毒, 转染72 h后收集细胞, 并于Prkka2低表达慢病毒组及Prkaa2空病毒组中用qRT-PCR检测Prkaa2敲减效率。设立TGF-β1诱导、Prkaa2RNAi+ TGF-β1诱导和Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导3个实验组, 同时以正常未作任何处理的NRK-52e细胞系为对照组。通过蛋白质印迹法检测Prkaa1、Prkaa2、α-平滑肌肌动蛋白(Alpha-smooth muscle actin, α-SMA)、E钙粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9 (cysteinyl aspartate specific proteinase9, Caspase9)和p53基因(p53)的表达。从Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组和Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导组中分别选取3个生物学重复样本, 通过Affymetrix基因表达谱芯片测序结果筛选差异表达的基因。然后, 在Prkaa2RNAi+TGF-β1、Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导2个实验组中验证Prkaa2、Rps6ka1的表达。结果 qRT-PCR及蛋白印迹检测结果显示, TGF-β1诱导12 h时NRK-52e细胞中Prkaa2的mRNA和蛋白的相对表达量分别为1. 368±0. 083和1. 311±0. 007, 与对照组1. 000±0. 123和1. 159±0. 009相比, 差异有统计学意义(P<0. 05)。qRT-PCR实验结果显示Prkaa2空病毒组相对表达量为1. 042± 0. 302, 较Prkaa2低表达慢病毒组为0. 171±0. 165 , Prkaa2 mRNA表达下调, 差异具有统计学意义(P= 0. 023)。蛋白质印迹法检测结果显示, TGF-β1诱导组E-cadherin相对表达量为2. 89±0. 04, 较对照组3. 82±0. 03下调, 差异有统计学意义(P<0. 05);TGF-β1诱导组Prkaa1相对表达量为1. 04±0. 04, 较对照组1. 06±0. 05未见明显变化, 差异无统计学意义(P>0. 05);TGF-β1诱导组α-SMA、Vimentin和Bax、Caspase9、p53相对表达量分别为3. 60±0. 03、1. 07±0. 07、1. 81±0. 02、1. 17±0. 04、0. 62± 0. 01, 均较对照组2. 95±0. 04、0. 74±0. 03、1. 00±0. 04、0. 77±0. 05、0. 37±0. 01上调, 差异均有统计学意义(P<0. 05)。Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组E-cadherin相对表达量为3. 57±0. 03, 较空病毒+ TGF-β1诱导组3. 04±0. 15上调, 差异有统计学意义(P<0. 05);Prkaa2RNAi+ TGF-β1诱导组Prkaa1相对表达量为1. 03±0. 05, 较空病毒+TGF-β1诱导组1. 05±0. 06未见明显变化, 差异无统计学意义(P>0. 05);Prkaa2RNAi+ TGF-β1诱导组Prkaa2、α-SMA、Vimentin和Bax、Caspase9、p53相对表达量分别为0. 54±0. 02、3. 21±0. 07、0. 44±0. 03、1. 16±0. 08、0. 94±0. 03、0. 44±0. 03, 均较空病毒+TGF-β1诱导组0. 89±0. 01、3. 49±0. 06、0. 98±0. 07、1. 87±0. 02、1. 21±0. 04、0. 65± 0. 03下调, 差异均有统计学意义(P<0. 05)。Affymetrix基因表达谱芯片测序结果显示核糖体蛋白S6激酶A1(ribosomal protein S6 kinase A1, Rps6ka1)下调。蛋白质印迹法和qRT-PCR验证结果提示, Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组Rps6ka1表达相对表达量为0. 60±0. 02、0. 590±0. 026, 较Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导组1. 15±0. 04、1. 003±0. 080下调, 差异有统计学意义(P<0. 05)。结论 Prkaa2与Rps6ka1存在正向调控关系, 抑制Prkaa2可以改善TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化。

• 单位
  中国医科大学附属盛京医院