稳定表达Notch1胞内结构域肺腺癌细胞株的构建及鉴定

作者：邹斌; 吴霞; 周学亮; 詹宇亮; 赖松青; 刘季春

来源：山东医药, 2017, 57(06): 5-8.

• 肺腺癌
• Notch蛋白
• 胞内结构域
• 慢病毒重组质粒

目的构建Notch1胞内结构域(N1ICD)稳定表达的肺腺癌A549细胞株。方法采用PCR方法扩增N1ICD基因,构建慢病毒重组质粒p HBLV-N1ICD-Zs Green-Puro(LV-N1ICD),采用PCR和基因测序鉴定重组质粒。高纯度无内毒素抽提慢病毒重组质粒和辅助包装原件载体质粒,使用慢病毒空载质粒(LV-Zs Green-Puro)和LVN1ICD共转染293T细胞包装慢病毒,利用药物筛选法测定病毒滴度。将A549细胞分成A549-N1ICD组和A549-Zs Green-Puro组,分别加入LV-N1ICD和LV-Zs Green-Puro,取制备好的慢病毒感染A549细胞,加入嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株,荧光显微镜观察转染效率,以带有绿色荧光的细胞初步视为稳定转染的细胞株。以A549细胞为对照组,进一步采用q PCR和Western blot方法分别检测N1ICD mRNA及蛋白表达。结果 PCR及基因测序结果表明pHBLV-N1ICD-Zs Green-Puro重组质粒构建成功。LV-N1ICD组病毒滴度为1×108TU/m L,LV-Zs Green-Puro组病毒滴度为1×108TU/m L。经嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜下观察细胞形态无明显变化,A549-Zs Green-Puro组和A549-N1ICD组70%80%的细胞带有绿色荧光。对照组、A549-Zs Green-Puro组、A549-N1ICD组的N1ICD mRNA相对表达量分别为1.59±0.11、1.09±0.10、70.81±6.39,A549-N1ICD组高于其他两组(P均<0.01)。三组N1ICD蛋白相对表达量分别为1.99±0.13、1.73±0.08、6.58±0.43,A549-N1ICD组高于其他两组(P均<0.01)。结论成功构建了稳定表达N1ICD的肺腺癌A549细胞株。

• 单位
  南昌大学第一附属医院