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摘要
目的构建大鼠下肢深静脉血栓(DVT)模型, 探讨组织因子(TF)表达及作用机制。方法构建TF小干扰RNA(siRNA)特异性沉默TF表达, 转染大鼠成纤维细胞RFL-6, 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)实验检测转染效率。通过大鼠尾静脉注射进行动物预处理及分组, 72只雄性6～8周龄无特定病原体(SPF)级SD大鼠采用随机数字表法随机分为空白对照组(6只)、假手术组(6只)、模型组(30只)、抑制组(30只), 空白对照组不进行任何处理, 假手术组仅进行开腹手术, 不结扎静脉, 模型组行开腹手术结扎静脉构建DVT模型, 抑制组在模型组基础上行TF siRNA预处理。分别于术后2、8、24、48、72 h处死大鼠, 取血清样本, RT-PCR实验检测不同组别大鼠血样中TF、组织因子途径抑制物(TFPI)、P选择素(P-selection)及P选择素糖蛋白配体1(PSGL-1) mRNA表达水平;酶联免疫吸附试验检测大鼠血清TF、TFPI、P-selection、PSGL-1表达水平, 多组数据间比较采用单因素方差分析, 两组数据间均数比较采用SNK-q检验;Spearman检验分析TF与各生物学指标在血栓形成中的关系。结果模型组大鼠术后静脉血中TF、TFPI、P-selection、PSGL-1 mRNA表达水平明显高于空白对照组和假手术组大鼠 [TF, 1.54±0.12、1.02±0.03、1.03±0.02(t=11.322, P<0.05);TFPI, 1.47±0.21、1.04±0.03、1.03±0.04(t=9.382, P<0.05);P-selection, 1.59±0.12、0.95±0.05、1.03±0.03(t=12.720, P<0.05);PSGL-1, 1.47±0.14、0.96±0.03、1.08±0.04(t=10.243, P<0.05)], 差异均有统计学意义, 模型组大鼠术后静脉血中TF、TFPI、P-selection、PSGL-1表达量均于空白对照组和假手术组大鼠 [TF, (102.42±8.42)、(56.32±5.64)、(52.43±6.32) ng/L(t=14.230, P<0.05);TFPI, (42.43±4.45)、(36.43±3.42)、(38.43±4.10) μg/L(t=10.188, P<0.05);P-selection, (34.32±4.43)、(21.32±3.24)、(23.43±3.20) μg/L(t=9.272, P<0.05);PSGL-1, (1 432.43±110.42)、(832.43±32.43)、(845.43±43.84) μg/L(t=10.054, P<0.05)], 差异均有统计学意义, 且模型组大鼠术后2、8、24 h时静血中TF、TFPI、P-selection、PSGL-1 mRNA表达水平明显高于空白对照组和假手术组大鼠 [TF, 1.54±0.12(t=7.282, P<0.05), 1.61±0.21(t=6.640, P<0.05), 1.97±0.22(t=8.022, P<0.05);TFPI, 1.47±0.21(t=11.022, P<0.05), 1.50±0.18(t=12.103, P<0.05), 0.52±0.20(t=11.039, P<0.05);P-selection, 1.59±0.12(t=11.651, P<0.05), 1.68±0.20(t=9.022, P<0.05), 2.23±0.31(t=7.292, P<0.05);PSGL-1, 1.47±0.14(t=8.023, P<0.05), 1.60±0.23(t=7.026, P<0.05), 2.20±0.34(t=8.554, P<0.05)], 模型组大鼠术后2、8、24 h时静血中TF、TFPI、P-selection、PSGL-1表达量也明显高于空白对照组和假手术组大鼠[TF, (102.42±8.42) ng/L(t=7.166, P<0.05), (135.43±8.53) ng/L(t=9.025, P<0.05), (158.76±22.32) ng/L(t=12.305, P<0.05);TFPI, (42.43±4.45) μg/L(t=15.021, P<0.05), (51.42±5.43) μg/L(t=11.353, P<0.05), (68.64±6.87) μg/L(t=13.004, P<0.05);P-selection, (34.32±4.43) μg/L(t=8.023, P<0.05), (42.43±5.11) μg/L(t=12.020, P<0.05), (59.56±8.31) μg/L(t=10.266, P<0.05);PSGL-1, (1432.43±110.42) μg/L(t=8.102, P<0.05), (1 544.32±96.43) μg/L(t=10.442, P<0.05), (1703.42±117.46) μg/L(t=9.225, P<0.05)], 差异均有统计学意义, 至术后24 h时达最高水平。模型组大鼠术后48 h及72 h静脉血中TF、TFPI、P-selection、PSGL-1 mRNA表达水平出现降低趋势。抑制组大鼠术后2、8、24、48、72 h时静脉血中TF、TFPI、P-selection、PSGL-1 mRNA表达水平明显低于空白对照组及假手术组 [TF, 0.43±0.01、0.53±0.01、0.59±0.02、0.61±0.03、0.62±0.01、2.02±0.22、2.02±0.24(t=14.385, P<0.05);TFPI, 0.45±0.02、0.50±0.02、0.58±0.02、0.60±0.02、0.61±0.03、0.51±0.18、0.50±0.20(t=13.022, P<0.05);P-selection, 0.34±0.03、0.55±0.03、0.67±0.04、0.60±0.02、0.55±0.03、2.02±0.16、1.79±0.14(t=15.335, P<0.05);PSGL-1, 0.40±0.02、0.54±0.02、0.71±0.04、0.62±0.03、0.57±0.03、1.84±0.16、1.65±0.15(t=10.283, P<0.05)], 差异均有统计学意义, 抑制组大鼠术后2、8、24、48、72 h时静脉血中TF、TFPI、P-selection、PSGL-1表达量明显低于空白对照组及假手术组 [TF, (34.64±5.64)、(50.53±10.54)、(65.43±11.42)、(48.42±12.42)、(38.42±10.24)、(102.32±7.43)、(93.43±6.48) ng/L(t=12.473, P<0.05);TFPI, (21.42±9.40)、(29.42±6.75)、(37.53±5.48)、(32.43±10.48)、(24.54±6.63)、(57.65±6.40)、(53.23±4.30) μg/L(t=11.255, P<0.05);P-selection, (13.42±2.23)、(15.54±3.02)、(18.76±2.43)、(15.43±1.43)、(11.43±2.03)、(43.43±5.03)、(37.65±5.11) μg/L(t=12.336, P<0.05);PSGL-1, (588.54±98.53)、(645.32±103.42)、(785.54±120.32)、(677.76±124.43)、(544.65±109.43)、(1 343.53±75.43)、(1 197.32±89.32) μg/L(t=8.102, P<0.05)], 差异均有统计学意义, 抑制组大鼠术后2、8、24 h时各观察指标呈增长趋势, 至术后24 h时达最高水平, 但静脉血中P-selection、PSGL-1 mRNA表达水平和TF、TFPI、P-selection、PSGL-1表达量均呈现降低表现。相关性分析结果显示, DVT模型中, 大鼠静脉血中TF表达水平与TFPI(r=0.632, P<0.05)、P-selection(r=0.513, P<0.05)、PSGL-1(r=0.651, P<0.05)呈明显正相关。结论大鼠DVT模型静脉血中, TF、TFPI、P-selection、PSGL-1表达量与血栓形成进程有关, TF表达与TFPI、P-selection、PSGL-1表达存在正相关, P-selection、PSGL-1可通过介导内皮细胞黏附影响TF表达, 调节血栓形成。
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