以聚乙二醇水凝胶膜为载体构建的角膜上皮移植片对LSCD治疗的可行性

作者：郭译远; 贤惠敏; Shereen Tan; Qiang Fu; 金鑫; Mark Daniel; Greg.G. Qiao; 张弘

来源：中华实验眼科杂志, 2022, 40(12): 1125-1133.

DOI：10.3760/cma.j.cn115989-20201125-00794

• 角膜上皮细胞
• 角膜缘干细胞缺乏症
• 聚乙二醇水凝胶膜
• 角膜上皮细胞再生
• 角膜上皮移植片

目的探讨聚乙二醇水凝胶膜(PHFs)是否能作为角膜上皮细胞(CECs)体外扩增的载体以及其能否用于角膜缘干细胞缺乏症(LSCD)的治疗。方法利用癸二酰氯、聚氧乙基甘油醚、聚已酸内酯二醇人工合成PHFs, 检测其厚度、透光度和机械拉伸性能。取清洁级新西兰大白兔4只, 培养原代角膜缘上皮细胞, 荧光显微镜下观察培养细胞中角蛋白标志物AE1/AE3和干细胞标志物p63的表达;将细胞分为阴性对照组、阳性对照组和PHFs+CECs组, 其中将阴性对照组细胞直接种植在培养皿底, 加入普通细胞培养液, 将阳性对照组细胞种植在培养皿后加入含有100 μmol/L H2O2的普通细胞培养液, 将PHF+CECs组细胞种植在铺有PHFs的培养皿中用普通细胞培养液培养, 各组培养24 h。采用MTT和TUNEL染色法分别观察3个组细胞增生和细胞凋亡情况。采用随机数字表法将清洁级新西兰大白兔15只分为对照组、PHFs组和PHFs+CECs组, 每组5只。其中对照组造模后不给予任何处置;PHFs组将空PHFs膜置于LSCD实验兔角膜表面;PHFs+CECs组为将CECs传代后种植于PHFs上构建组织工程移植片后将移植片置于LSCD兔模型的角膜表面。采用荧光素染色法检测各组实验兔角膜缺损面积大小并评分;采用苏木精-伊红染色法检测各组实验兔角膜上皮组织学特点。结果 PHFs厚度不超过150 μm, 能承受约6 MPa的拉力, 在400～700 nm可见光范围内透过率>99%。角膜缘原代培养的大多数细胞AE1/AE3染色和p63染色阳性。MTT实验结果显示, PHFs+CECs组、阴性对照组和阳性对照组A490值分别为0.59±0.01、0.65±0.07和0.06±0.04, 总体比较差异有统计学意义(F=12.25, P<0.05), 其中PHFs+CECs组和阴性对照组A490值明显大于阳性对照组, 差异有统计学意义(均P<0.05)。TUNEL检测结果显示, PHFs+CECs组、阴性对照组和阳性对照组TUNEL阳性细胞率总体比较差异有统计学意义(F=13.45, P<0.05), 其中PHFs+CECs组和阴性对照组TUNEL阳性细胞率明显低于阳性对照组, 差异均有统计学意义(均P<0.05)。荧光素染色结果显示, 随着术后时间的延长, 各组角膜荧光素钠染色评分均降低, 对照组、PHFs组和PHFs+CECs组角膜荧光素钠染色评分依次降低。苏木精-伊红染色结果显示, 对照组存在较少形状不规则的角膜上皮细胞, PHFs组一些区域出现单层稀疏的角膜上皮细胞;PHFs+CECs组角膜上皮覆盖范围最大, 细胞层数增加到3～5层, 形态较规则, 排列较紧密。结论 PHFs韧性强、透光度高且能够体外扩增角膜上皮, 适合做角膜上皮移植片, 并能促进LSCD兔模型角膜上皮的修复。