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摘要
黄病毒RNA复制子在病毒致病机制、新型疫苗和药物研发上应用广泛，而坦布苏病毒(Tembusu virus, TMUV)是我国新发现的以引起水禽产蛋量下降为主要特征的黄病毒属成员。为构建TMUV RNA复制子，本研究以TMUV JXSP株感染性克隆为基础，利用Overlap PCR分别对病毒基因组进行CPrME、CPrM、PrME和PrM等4种方式结构蛋白基因的缺失，并在缺失部位插入绿色荧光蛋白报告基因，报告基因下游连接口蹄疫病毒2A蛋白基因序列，获得的基因组全长PCR融合产物纯化后，体外转录成mRNA,并转染至BHK-21细胞，采用荧光显微镜观察不同时间点绿色荧光蛋白的表达；利用构建的TMUV RNA复制子，将绿色荧光蛋白基因替换为H9亚型禽流感病毒HA基因，mRNA转染细胞72 h后Western blotting检测蛋白表达。结果显示，4种TMUV RNA复制子转染细胞的胞浆和胞核内均能观察到明显的绿色荧光信号；Western blotting能检测到HA蛋白的表达。结果表明，本研究成功构建了ΔCPrME、ΔCPrM、ΔPrME和ΔPrM等4种能有效表达外源基因的TMUV RNA复制子。
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