构建携带人GFAP启动子和p27基因的重组腺病毒载体及其转染对星形胶质细胞增殖的影响

作者：刘娜; 聂璐薇; 姚达宝; 陈施玲; 潘超; 徐莉^*

来源：神经损伤与功能重建, 2023, 18(10): 564-573.

DOI：10.16780/j.cnki.sjssgncj.20230629

• p27
• GFAP启动子
• 细胞周期
• 腺病毒载体
• 星形胶质细胞

目的：构建携带人GFAP启动子和p27基因的重组腺病毒载体并进行鉴定，研究其转染星形胶质细胞后对细胞生长增殖的影响。方法：对实验室原有的pGFAP-IRES2-EGFP-p27质粒进行转化、扩增、抽提、酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定和测序；通过设计引物，进行PCR扩增后分别获取GFAP启动子和p27基因片段，依次交换入线性化表达载体GV269和p DC315-GFAP-EGFP载体，最终构建pDC315-GFAP-p27-EGFP；将其转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒，经在HEK293细胞反复扩增数代后，进行纯化及滴度检测；转染星形胶质细胞后观察细胞生长和荧光表达情况；检测转染后星形胶质细胞细胞周期和凋亡比例、p27的表达情况。结果：经酶切鉴定和测序，成功鉴定真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27；经PCR鉴定和测序，成功构建重组腺病毒过表达载体pDC315-GFAP-p27-EGFP；经包装后，Ad-GFAP-p27-EGFP可见EGFP表达和细胞致病效应，而且能够特异性地在星形胶质细胞中表达绿色荧光蛋白；经流式细胞仪分析，转染星形胶质细胞72 h后，与对照组相比，转染组处于S期的细胞比例下降，G1和G2期的细胞比例增高，凋亡比例增高（P<0.05）；转染后第5天，星形胶质细胞中p27蛋白表达水平较对照组有明显升高（P<0.05）。结论：利用腺病毒包装系统AdMax成功构建了携带人GFAP启动子和p27基因的重组腺病毒过表达载体，其可以特异性转染星形胶质细胞过表达p27，对星形胶质细胞的生长增殖有明显抑制作用。

• 单位
  神经内科; 华中科技大学同济医学院附属同济医院