核酸去甲基酶AlkB在毕赤酵母中的表达纯化及在tRNA相关研究中的应用

作者：崔璐瑶; 李安娜; 林茹; 张嘉禛; 施嘉诚; 周勉^*

来源：微生物学报, 2023, 63(03): 1088-1098.

DOI：10.13343/j.cnki.wsxb.20220522

• 毕赤酵母
• 去甲基酶
• AlkB
• tRNA
• 酶学性质

[目的]核酸的甲基化修饰是一种常见的化学修饰形式,具有重要的生物学功能,却也在一定程度上给一些核酸研究过程带来了技术难度。tRNA上具有的大量甲基化修饰会阻碍逆转录进程,从而降低荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和高通量测序对其的检测效率。来自大肠杆菌(Escherichia coli)的AlkB蛋白是一种多功能的脱烷基化酶,可以去除DNA和RNA上多种甲基化为代表的修饰,有望解决以上问题。[方法]针对大肠杆菌来源的AlkB,分别尝试在大肠杆菌和毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中进行诱导表达和纯化,对纯化获得的AlkB进行酶学性质测定。最后以tRNAUAUIle等两种tRNA为代表,研究AlkB的处理对于荧光定量PCR法检测tRNA表达水平的影响。[结果]AlkB在大肠杆菌中表达时多以包涵体形式存在,但是在毕赤酵母中可以成功分泌表达。使用镍柱分离纯化后获得了纯度高于95%的AlkB蛋白,其酶学性质参数如下:最适反应温度为25℃,最适pH值为6.5,Vmax为0.39μmol/(L·min),Km为3.23μmol/L,比酶活为1.08 U/mg。AlkB对RNA的处理可以增加荧光定量PCR对tRNA表达水平检测的准确度。[结论] AlkB可以在毕赤酵母中高效表达并纯化,其处理有助于荧光定量PCR对于tRNA的检测结果变得更准确。AlkB的各项酶学性质特征在相关理论研究和应用中具有一定的科学价值。

• 单位
  生物反应器工程国家重点实验室; 华东理工大学