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摘要
磷酸甘油酸激酶(PGK)是生物进行糖酵解的关键酶,目前未见关于鸡滑液支原体(MS)PGK的相关研究报道。本实验采用Overlap PCR方法对MS的pgk基因进行点突变扩增,然后连接至pET-28a(+)表达载体并在大肠杆菌BL21中表达,纯化获得重组MSPGK(rMSPGK)蛋白,然后对纯化后的rMSPGK蛋白的酶学活性进行测定,包括温度、pH及不同底物对酶活的影响,并计算其酶比活力、米氏常数及最大反应速率。结果显示:最终获得了纯化的rMSPGK蛋白,其相对分子质量约为45 kDa;酶学活性测定显示,rMSPGK蛋白的酶比活力为100.70 IU/mg,最适酶促温度为37℃,最适pH为7.5;双倒数法求得rMSPGK蛋白相对于3-PGA的最大反应速率Vmax为370.37 μmol/(L?min),米氏常数Km值为3.88 mmol/L;相对于ATP的最大反应速率Vmax为357.14 μmol/(L?min),Km值为0.25 mmol/L。综上,本实验成功地表达了MS的PGK蛋白,并获得了酶活力较高的rMSPGK蛋白,为进一步研究鸡滑液支原体代谢和致病机制奠定了基础。
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