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摘要
【目的】探讨禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)外膜蛋白OmpA对DF-1细胞自噬的影响，为研究OmpA是否协助APEC逃逸宿主细胞自噬介导的清除作用提供依据。【方法】以APEC E058株基因组DNA为模版，通过PCR扩增回收ompA基因片段，经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆至真核表达载体pEGFP-N1,通过酶切及测序鉴定筛选阳性的重组表达质粒pEGFP-N1-ompA;随后将质粒转染至鸡胚成纤维细胞DF-1并通过Western blotting和免疫荧光试验检测OmpA蛋白的表达情况；通过透射电子显微镜、免疫荧光试验及Western blotting方法检测OmpA对DF-1细胞自噬的影响。【结果】测序鉴定正确的重组质粒pEGFP-N1-ompA经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，获得大小分别为1 038和4 700 bp的条带，大小与载体和目的片段相符，表明真核表达质粒pEGFP-N1-ompA构建成功。将重组质粒经脂质体转染DF-1细胞后，通过免疫荧光试验可观察到大量绿色荧光，Western blotting检测到大小为65 ku的蛋白条带，表明成功转染pEGFP-N1-ompA至DF-1细胞中并大量表达ompA-EGFP融合蛋白。同时Western blotting结果显示，过表达OmpA可引起自噬标志性蛋白LC3Ⅱ的表达量增加；通过透射电子显微镜可观察到DF-1细胞中的自噬小体。将单荧光GFP-LC3质粒转染DF-1细胞，OmpA蛋白处理组呈现绿色荧光点的聚集，说明OmpA引发DF-1细胞自噬。进一步研究发现，OmpA影响自噬标志蛋白p62降解，转染双荧光mRFP-GFP-LC3质粒检测显示OmpA可阻断自噬流的发生。【结论】APEC外膜蛋白OmpA可引起DF-1细胞发生自噬，但其抑制自噬流的发生，引发DF-1细胞的不完全自噬，这将为进一步探讨APEC逃逸宿主细胞的清除作用提供参考。
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