血浆宏病毒组学中降低非病毒核酸方法的探索研究

作者：刘安庆; 杨春晖; 赵玉伟; 赵梦伊; **; 黄杨; 何苗^*

来源：中国输血杂志, 2023, 36(05): 388-395.

DOI：10.13303/j.cjbt.issn.1004-549x.2023.05.006

• 输血传播病毒
• 血浆宏病毒组
• 降低非病毒核酸
• 高通量测序

目的 探究常用的降低非病毒核酸方法对血浆病毒组丰度的影响。方法 应用3种建库流程、5种离心条件、2种滤器、4种酶和4种含量氯仿处理定量投入伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)各2.16 mL的模拟宏病毒组血浆标本共21.6 mL,累计54份标本，随后提取病毒核酸、用qPCR定量检测线粒体DNA(mtDNA)和病毒、构建二代测序(NGS)文库并应用NGS测序仪测序，测序数据用Kraken Py2.0软件做比对并做物种注释分析，得到每个片段对应的物种分类信息以分析降低非病毒核酸的不同方法对微生物和2种指示病毒相对丰度的影响。结果 NGS测序仪测序：306.27 GB raw data, 193.17 GB clean data,所有的测序数据Q20>90%、Q30>85%,碱基错误率0.03%,GC含量中位数为45.02%。DNA建库流程提高了微生物序列占比和PRV丰度[(91.8±0.5)%](P<0.05);RNA建库和合并建库提高了RNA病毒——瘟病毒(Pestivirus)的丰度，PRV丰度分别为(17.7±3.3)%和(8.1±1.5)%。5种离心条件处理后mtDNA Ct值增加、人类序列降低至占比<(89.5±1)%、微生物序列升高至占比>(2.4±0.03)%(P<0.05);在4℃、100 g离心30 min后PRV丰度提升至(40.6±6)%,再于4℃、4 000 g离心45 min后PRV丰度下降至(4.1±0.01)(P<0.05)。依次使用0.22和0.45μm滤器使mtDNA增加至Ct值>25.56±0.13,人类序列降低至占比<(86.1±0.6)%,微生物序列占比升高至(3.1±0.1)%和(3.4±0.2)%,PRV Ct增加至25.77±0.20、25.56±0.13,PRV丰度下降至(1.6±0.3)%、(4.1±0.7)%(P<0.05)。DNaseⅠ和Benzonase使PPV Ct值增加至25.65±0.06、25.36±0.45,人类序列占比分别下降至(81.7±5.6)%、(72.8±6.7)%,微生物序列占比和PRV丰度分别上升至(11.0±4.1)、(16.1±4.7)%,(55.8±2.3)%、(39.0±8.9)%(P<0.05);RNase A处理后使PRV Ct值增加至25.20±0.11,人类序列占比降低至(85.4±5.6)%(P<0.05);溶菌酶无降低非病毒核酸效果。1%、5%、10%和20%氯仿使mtDNA和PRV Ct值增加至不低于27.17±0.21、25.68±0.04(P<0.05),10%氯仿处理后将微生物序列占比提升至(3.1±1.2)%(P<0.05);1%和5%氯仿分别使PRV丰度上升至(48.7±13.3)%、(42.1±5.5)%(P<0.05),10%和20%氯仿分别使PRV丰度下降至(1.0±0.5)%、(3.4±2.8)%(P<0.05),4种氯仿对PPV丰度无明显影响(P>0.05)。结论 本研究中4℃、5 000 g离心10 min适于提升指示病毒组整体的丰度，4℃100 g离心30 min适于提高与PRV性质相似病毒含量；0.45μm滤器、DNaseⅠ和Benzonase及低浓度氯仿均能有效降低血浆中非病毒核酸序列占比从而提升指示病毒组丰度。血浆宏病毒组中降低非病毒核酸的不同方法对病毒浓度和丰度的影响与病毒基因组种类、病毒大小和是否具有包膜等密切相关，具有病毒特异性。

• 单位
  成都市血液中心; 中国医学科学院北京协和医学院