补体因子H关键结构域野生型及突变型克隆载体的构建表达与功能初探

作者：范新萍; 林雅军; 刘璞; 岳育红^*

来源：中国医学前沿杂志(电子版), 2022, 14(05): 6-14.

• 补体因子H
• 短同源重复序列
• 克隆
• 蛋白表达

目的 构建并表达补体因子H (complement factor H,CFH)关键结构域蛋白,即野生型短同源重复序列(short consensus repeats,SCR)7和SCR19-20,突变型SCR7 Y402H、SCR19-20 R1210C、SCR19-20 R1215Q,探讨CFH基因突变导致补体过度激活疾病的可能机制。方法 采用In-Fusion反应,将编码SCR7 (386～446位氨基酸)和SCR19-20 (1 107～1 231位氨基酸)的c DNA序列分别克隆入p ET-47b (+)载体,定点突变引入3个预期突变位点Y402H、R1210C和R1215Q,再将携带p ET-47b (+)载体6-His纯化标签的CFH-SCR7和CFH-SCR19-20野生型和突变型重组质粒导入穿梭载体p NCMO2,在短芽孢杆菌中进行上述蛋白结构域的表达、Ni-NTA树脂纯化、SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹法鉴定。通过检测其与肝素的亲和能力初步鉴定野生型与突变型的功能差异。结果 成功构建了CFH关键结构域SCR7和SCR19-20的野生型和突变型重组表达载体p NCMO2-SCR7、p NCMO2-SCR19-20、p NCMO2-SCR7 Y402H、p NCMO2-SCR19-20 R1210C、p NCMO2-SCR19-20 R1215Q。5种重组体均高效表达且经抗6-His抗体和特异性抗CFH单克隆抗体进行蛋白质印迹法实验验证均为相应正确蛋白。SCR7 Y402H比野生型的肝素亲和力强,R1210C和R1215Q均比SCR19-20野生型亲和力弱。结论 成功构建并表达了CFH SCR7和SCR19-20突变体,初步鉴定了突变蛋白结构域的功能,为体外进一步研究CFH基因突变致补体过度激活类疾病发生的可能机制奠定了实验基础。

• 单位
  中国医学科学院; 北京医院; 首都医科大学附属北京朝阳医院