人BRAF野生型及V600E突变型真核表达载体的构建及表达

作者：程张军; 石欣; 汤永辉; 高乃荣

来源：世界华人消化杂志, 2008, (21): 2395-2398.

• BRAF
• 胰腺癌
• 逆转录聚合酶链式反应
• Western blot
• 克隆
• 真核表达

目的:构建BRAF野生型和V600E突变型真核表达载体;转染并筛选稳定表达BRAF的胰腺癌细胞株,为探讨BRAF V600E突变在胰腺癌发生发展中的作用提供合适的细胞模型.方法:将BRAF野生型及V600E突变型cDNA克隆于真核表达载体pCMV-Myc中,构建pCMV-Myc-BRAFW及pCMV-Myc-BRAF V600E重组质粒,酶切鉴定、测序证实序列正确后,利用脂质体将重组质粒转染胰腺癌细胞Panc-1,经G418培养筛选获得抗性细胞克隆,用RT-PCR和Western blot鉴定野生型和V600E突变型BRAF基因在Panc-1细胞中的表达.结果:酶切鉴定和序列分析证实,重组克隆pCMV-Myc-BRAFW和pCMV-Myc-BRAF V600E序列正确,RT-PCR和Western blot结果显示G418筛选获得的转基因Panc-1细胞稳定表达BRAF和BRAF V600E.结论:成功构建了pCMV-Myc-BRAFW和pCMV-Myc-BR AFV600E真核表达载体,建立了稳定表达BRAF和BRAF V600E的胰腺癌细胞株.

• 单位
  东南大学附属中大医院