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摘要
目的构建DKK1基因过表达慢病毒载体,并探讨其是否能在大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12中高效、稳定表达。方法 PCR法扩增DKK1基因序列,将其转入质粒并整合到载体上,构建GV358-DKK1慢病毒表达载体;将构建成功的目的质粒和辅助包装质粒共转染293T细胞对慢病毒进行包装,荧光显微镜观察基因在293T细胞中的表达,用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。将培养好的PC12细胞随机分为三组,空载体阴性对照组、PC12-DKK1组分别用制备的空载体慢病毒及GV358-DKK1颗粒进行感染,空白对照组常规培养。用qRT-PCR和Western blotting法分别检测PC12细胞中DKK1 mRNA与蛋白的相对表达量。结果限制性内切酶鉴定及测序结果提示GV358-DKK1慢病毒表达载体构建成功,转染293T细胞获得高滴度的病毒。PC12-DKK1组DKK1 mRNA及蛋白相对表达量均较空载体组、空白对照组高(P均<0.05)。结论 DKK1基因过表达慢病毒载体构建成功,且其可在PC12细胞中稳定表达。
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