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摘要
目的 基于PCR-核酸试纸条技术，建立快速检测制药用水中皮氏罗尔斯顿菌的方法。方法 利用煮沸法提取皮氏罗尔斯顿菌基因组DNA，以皮氏罗尔斯顿菌16S rDNA为靶基因使用NCBI primer-BLAST 5.0设计一对特异性引物，经克隆转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，鉴定PCR产物；分别在引物的5’端标记FITC与Biotin；组装核酸试纸条，建立PCR-核酸试纸条的方法；优化反应体系中胶体金标记的链霉亲和素与抗体浓度的最佳工作量；并对试纸条进行反应原理验证及灵敏度、特异性、稳定性评价；对某生物科技有限公司制药用水检测出的7株皮氏罗尔斯顿菌进行实验并利用MEGA构建进化树，对污染溯源进行分析。结果 煮沸法提取基因组浓度较好，纯度1.8～2.0;PCR产物经克隆转化、测序比对，与GenBank已登记的皮氏罗尔斯顿菌16S rDNA相似度为100%；利用胶体金放大原理，每100μL胶体金溶液中，加入3.5μL链霉亲和素进行标记，硝酸纤维素膜上检测线为2.0 mg/mL抗FITC抗体，质控线为1.2 mg/mL生物素化BSA，与阳性扩增产物结合产生红色条带；按照优化条件进行试纸条组装，每100μL样品展开液中加入8μL PCR产物，反应5 min后观察结果；核酸试纸条特异性结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致，仅有皮氏罗尔斯顿菌为阳性结果，不动杆菌、气单胞菌、假单胞菌、非脱羧勒克氏菌均为阴性结果；核酸试纸条灵敏度评价，将DNA浓度降至10-5ng/μL时，试纸条检测线仍有条带，较琼脂糖凝胶电泳结果灵敏度高1000倍；核酸试纸条稳定性评价，将试纸条在3、6、9、12月进行检测，稳定性较好。结论 建立PCR-核酸试纸条技术检测制药用水中皮氏罗尔斯顿菌，具有简单快速、特异性强、灵敏度高、成本较低等优点，适用于制药企业对制药用水的日常检测。
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