基于CRISPR/Cas9技术建立 Pkd1基因条件敲除的多囊肾小鼠模型

作者：马广强; 王荣亮; 牛玲; 万红娇; 闫成花; 王立元^*

来源：中华肾脏病杂志, 2023, 39(09).

• 多囊肾疾病
• 小鼠, 基因敲除
• CRISPR-Cas系统
• Pkd1基因
• Cre-loxP

目的基于CRISPR/Cas9和Cre-loxP基因编辑技术建立多囊肾病1(polycystic kidney disease 1, Pkd1)基因条件敲除小鼠模型, 为深入研究Pkd1基因在多囊肾病发生中的作用提供动物模型。方法采用In-Fusion技术构建打靶载体, 根据Pkd1基因制备对应的gRNA、Cas9 mRNA及携带loxP位点的供体载体, 共同注射于C57BL/6N小鼠的受精卵内。将受精卵转移至有假孕状态雌性小鼠的输卵管内部。幼鼠出生后经PCR鉴定及测序分析分选出Pkd1flox/flox基因型F0代阳性小鼠, 后者与野生型小鼠配繁, 筛选出后代基因型为Pkd1flox/+的F1代杂合子小鼠, 内部扩繁获得基因型为Pkd1flox/flox的F2代纯合子小鼠, 该基因型小鼠再与Cre阳性表达的Ggt1-Cre小鼠杂交, 获得Pkd1flox/+Ggt1Cre基因型的F3代小鼠, F3代自交或与F2代Pkd1flox/flox回交得到Pkd1flox/floxGgt1Cre基因型的F4代小鼠, 即肾脏特异性Pkd1基因敲除(Ggt1-cKO)小鼠。采用PCR法鉴定小鼠基因型, 按基因鉴定结果分为野生型对照(WT)组(n=6)、Pkd1纯合子对照(PKD)组(n=6)和Ggt1-cKO敲除验证(CKO)组(n=6)。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组小鼠肾脏和其他器官组织中Pkd1 mRNA的表达;HE染色检查各组小鼠肾组织病理改变;自动生化检测仪检测小鼠血清尿素氮和血清肌酐含量, 并计算肾脏系数。结果 PCR检测结果显示, CKO组子代小鼠基因型符合Pkd1flox/floxGgt1Cre。Pkd1基因仅在肾脏特异性表达, 其余组织中均未见表达。RT-qPCR结果显示, CKO组小鼠肾脏髓质Pkd1 mRNA相对表达量显著低于WT组和PKD组(均P<0.05)。肉眼可见CKO组小鼠肾脏体积较WT组增大了1倍左右, 光镜下可观察到CKO组小鼠肾脏有多个大小形态不一的空泡, 髓质组织间隙明显增加。CKO组小鼠肾脏系数、血清尿素氮和血清肌酐含量均显著高于WT组和PKD组(均P<0.05)。结论基于CRISPR/Cas9和Cre-loxP基因编辑技术可成功构建Pkd1基因条件敲除小鼠, 为进一步研究Pkd1基因在多囊肾病发生中的作用机制提供动物模型。

• 单位
  江西中医药大学