植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化pH范围的理性改造及高效转化生产γ-氨基丁酸

作者：肖杰文; 韩瑾; 乔郅钠; 张国栋; 黄武军; 钱凯; 徐美娟; 张显; 杨套伟; 饶志明^*

来源：生物工程学报, 2023, 39(06): 2108-2125.

DOI：10.13345/j.cjb.221012

• γ-氨基丁酸
• 谷氨酸脱羧酶
• pH改造
• 表面电荷
• 全细胞转化

氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)催化谷氨酸一步合成，反应体系成分简单、环境友好。然而，绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小，需要加入无机盐维持最适催化环境，增加了生产附加成分。此外，随着产物γ-氨基丁酸的生成，溶液pH会逐渐上升，不利于GAD酶的持续转化。本研究首先从实验室保藏的一株高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到谷氨酸脱羧酶LpGAD，基于酶蛋白表面电荷修饰，选择9个位点进行定点突变及组合突变，酶学性质表征结果显示三突变体LpGADS24R/D88R/Y309K在催化pH区间内酶活力整体提高，尤其拓宽了在偏中性pH 6.0下的酶活，为野生酶的1.68倍。接下来，通过分子动力学模拟解析了酶活提高的机理。此外，将Lpgad与LpgadS24R/D88R/Y309K突变基因分别在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)E01中过表达，通过优化确定了摇瓶最适转化条件为反应温度40℃，菌体量OD600=20，底物L-谷氨酸100.0 g/L,5-磷酸吡哆醛添加量为100μmol/L。5 L发酵罐中，不调节pH，通过分批投料底物L-谷氨酸，γ-氨基丁酸产量高达402.8g/L，较对照菌株提高了1.63倍。本研究成功拓宽了LpGAD的pH催化范围及酶活，提高了γ氨基丁酸的转化效率，为实现其规模化工业生产奠定了基础。

• 单位
  江南大学; 生物工程学院