牛病毒性腹泻病毒链特异性SYBR Green荧光定量PCR方法的建立及应用

作者：刘存; 邓永; 梁琳; 李金祥; 张彦明; 崔尚金^*

来源：畜牧兽医学报, 2019, 50(10): 2079-2087.

• 牛病毒性腹泻病毒
• 非病毒核苷酸序列标签
• 荧光定量PCR方法

为了对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)复制过程中正、负链RNA进行定量检测,通过生物学软件DNAStar和Primer express 3.0设计BVDV正、负链RNA特异性反转录引物并在其5′端添加非病毒核苷酸标签序列以区分BVDV正、负链RNA。同时设计荧光定量PCR引物与非病毒核苷酸标签序列组成引物对,建立了BVDV链特异性荧光定量RT-PCR(ssRT-qPCR)方法,对其敏感性、重复性、特异性进行评估并利用所建立BVDV ssRT-qPCR对不同接毒剂量下BVDV在细胞内复制过程中正、负链RNA进行定量检测。结果表明,以构建的pMD18T-BV+和pMD18T-BV-质粒为标准品建立的BVDV正链特异性荧光定量RT-PCR方法[ss(+)RT-qPCR]和负链特异性荧光定量RT-PCR方法[ss(-)RT-qPCR]在102～107拷贝范围内具有良好的线性关系,线性相关系数分别为0.998 1和0.995 3;敏感性试验结果显示,ssRT-qPCR敏感性较好,ss(+)RT-qPCR最低检测下限为10拷贝,ss(-)RT-qPCR最低检测下限为100拷贝。重复性试验结果显示,所建立的ssRT-qPCR批内和批间的变异系数为均小于1%,方法重复性良好。特异性试验显示,所建立的ssRT-qPCR方法与牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒等不存在交叉反应,特异性较好。利用建立的ssRT-qPCR对不同感染剂量下细胞内BVDV正、负链RNA进行定量分析,结果显示以10、0.1 MOI剂量接种BVDV于MDBK细胞后,BVDV正、负链RNA变化呈现先升后降再逐渐上升的趋势。以1 MOI剂量感染MDBK细胞,BVDV正、负链RNA的动态变化趋势略有差异,整体呈上升趋势。10、1 MOI接毒剂量接种细胞后,BVDV正、负链RNA在感染后36 h基本维持稳定水平,以0.1 MOI接种细胞后BVDV正、负链RNA在感染后24 h即达到稳定水平。BVDV链特异性检测进一步验证了所建立方法的适用性。该研究建立了BVDV链特异性荧光定量RT-PCR方法并利用该方法对BVDV在细胞内复制过程中正、负链RNA的动态变化过程进行描述,为研究宿主蛋白抗病毒机制、BVDV基因组RNA复制及调控机制等研究提供了研究手段。

• 单位
  西北农林科技大学; 中国兽医药品监察所; 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所; 农业部