基于CRISPR/Cas9系统建立GPR108缺失的THP-1细胞株及其功能初步研究

作者：王雯雯; 涂珍珍; 臧丹丹; 汪璟; 张银涛; 周海胜^*

来源：安徽医科大学学报, 2023, 58(04): 528-533.

DOI：10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2023.04.002

• GPR108
• THP-1细胞
• CRISPR/Cas9
• IL-8

目的 建立稳定敲除G蛋白偶联受体108(GPR108)基因的人单核细胞白血病细胞系(THP-1),并初步研究其功能。方法 根据人GPR108基因序列设计，合成可应用于成簇有规律的间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)的单链引导RNA(sgRNA1和sgRNA2)对应的DNA,利用分子克隆技术在pL-CRISPR.EFS.GFP慢病毒载体中插入sgRNA1和sgRNA2序列，构建重组载体(pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA1和pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA2)。将测序正确的重组体与包装质粒(pMD2.G和psPAX2)共转染293T细胞进行病毒包装，收集病毒液并感染THP-1细胞。利用流式细胞分选技术分离GFP+细胞于96孔培养板中，培养获得单细胞克隆。利用聚合酶链式反应(PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测THP-1细胞中GPR108是否敲除成功。应用脂多糖(LPS)刺激GPR108-/-和GPR108+/+的THP-1细胞，Western blot法检测细胞内白细胞介素-8(IL-8)的表达，流式微球技术(CBA)检测细胞培养上清液中的IL-8浓度。结果 成功构建重组慢病毒载体pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA,转染THP-1细胞后通过流式细胞仪分选获得单细胞克隆F9。PCR和Western blot法均证实F9是GPR108-/- THP-1单细胞克隆。LPS刺激GPR108-/-和GPR108+/+ THP-1细胞，Western blot和CBA的结果均显示敲除GPR108的THP-1细胞中IL-8的合成和分泌明显减少。结论 成功建立GPR108缺失的THP-1细胞株；缺失GPR108的THP-1细胞在受到LPS刺激时产生的趋化因子IL-8显著降低。为后续研究GPR108在免疫炎症中的作用奠定了基础。

• 单位
  生物化学教研室; 安徽医科大学