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摘要
为建立一种可区分非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株和基因缺失疫苗株的荧光定量PCR方法，本研究根据ASFV HLJ/2018株(MK333180.1)I177L及p72基因序列，设计特异性引物及探针，经反应条件优化后建立一种双重Taq Man荧光定量PCR方法。绘制的标准曲线结果显示，两个重组质粒标准品p18T-I177L和p18T-p72相关系数R2均在0.99以上，扩增效率E为88%～90%。表明两个重组质粒标准品的拷贝数均与各自的Ct值有良好的线性关系。特异性试验结果显示，该方法仅特异性扩增ASFV I177L和p72基因，对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应；敏感性试验结果显示，该方法对p18T-I177L和p18T-p72质粒标准品的检测下限分别为4.63×102拷贝/μL和4.09×102拷贝/μL，敏感性较高；重复性试验结果显示，组内和组间重复性试验的变异系数均小于1.4%，重复效果好。分别利用该方法与ASFV荧光定量PCR检测试剂盒检测57份猪鼻拭子核酸样品，结果显示该方法检测出47份阳性核酸，10份阴性核酸样品。ASFV荧光定量试剂盒检测出46份阳性核酸，11份阴性核酸样品。二者的总符合率达94.7%，且二者的Kappa=0.825>0.75,P=1>0.05，表明两种方法无统计学差异且一致性良好。本研究建立的双重荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好，可用于ASFV的检测、鉴别检测和流行病学的调查研究。
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