小分子RNA干扰雷帕霉素靶蛋白基因表达对百草枯致大鼠肺纤维化的影响

作者：杨文彬; 赵小青; 梁冉; 陈达

来源：中华危重病急救医学, 2017, 29(09): 830-835.

• 百草枯
• 雷帕霉素靶蛋白
• 肺纤维化
• 慢病毒
• 大鼠

目的探讨小分子RNA干扰雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因表达对百草枯致大鼠肺纤维化的影响。方法体外培养人胚肾细胞HEK-293,构建mTOR小干扰RNA(mTOR-siRNA)表达质粒转染慢病毒,并以与mTOR基因无同源性的非特异性序列质粒作为对照。将72只健康雄性SD大鼠按随机数字表法分为生理盐水(NS)对照组、百草枯模型组、mTOR无关序列组、mTOR-siRNA组,每组18只。经腹腔注射20%百草枯溶液15 mg/kg制备百草枯中毒动物模型,NS对照组腹腔注射等量NS;mTOR无关序列组和mTOR-siRNA组大鼠分别经气道内注入滴度为1×109 TU/mL的慢病毒溶液50μL,NS对照组和百草枯模型组注入等量NS。各组分别于7、14、28 d处死6只大鼠取肺组织,光镜下观察病理学改变及纤维化情况;采用碱水解法检测肺组织羟脯氨酸(HYP)水平;采用反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)分别检测肺组织mTOR的mRNA和蛋白表达。结果光镜下显示,NS对照组肺组织无明显病理学改变;百草枯模型组和mTOR无关序列组肺组织结构破坏,有大量炎性细胞浸润,并出现大量基质胶原及纤维组织增生,且随时间延长逐渐加重,符合百草枯致肺组织纤维化过程;而mTOR-siRNA组沉默mTOR基因后肺组织病理学及纤维化改变明显减轻。百草枯模型组和mTOR无关序列组肺组织HYP水平以及mTOR mRNA和mTOR蛋白表达量均呈时间依赖性持续升高,且明显高于NS对照组相应时间点;而mTOR无关序列组与百草枯模型组无明显差异。mTOR-siRNA组沉默mTOR基因后能抑制百草枯中毒导致肺组织中HYP的生成,以及mTOR mRNA和mTOR蛋白的表达量升高,其值接近NS对照组水平,在7 d或14 d时与百草枯模型组出现统计学差异,并持续至28 d[7 d:HYP(μg/mg)为1.13±0.06比1.25±0.07;,14d:HYP(μg/mg)为1.19±0.09比1.29±0.12,mTOR mRNA(2-△△Ct)为0.99±0.11比1.94±0.12,mTOR蛋白(灰度值)为0.39±0.08比0.75±0.09;28d:HYP(μg/mg)为1.28±0.06比1.40±0.05,mTORmRNA(2-△△Ct)为1.15±0.13比2.85±0.15,mTOR蛋白(灰度值)为0.45±0.10比0.86±0.12,均P<0.05]。结论慢病毒介导的mTOR-siRNA可有效抑制百草枯中毒大鼠肺组织中mTOR表达,减轻百草枯致肺组织损伤和纤维化程度。

• 单位
  中国医科大学; 肥城矿业中心医院