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摘要
目的探讨肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)第331位泛素化位点突变对结直肠癌细胞生物学特征的影响及其相关机制。方法将带有绿色荧光蛋白标签的TRAF6基因表达质粒的慢病毒(pCDH-3×FLAG-TRAF6)和突变质粒慢病毒(pCDH-3×FLAG -TRAF6-331mut)分别感染结直肠癌细胞SW480和HCT116, 荧光显微镜观察细胞感染情况, Western blot检测TRAF6和TRAF6-331mut在细胞中的表达。采用细胞计数试剂盒8法和平板克隆实验检测TRAF6组和TRAF6-331mut组结直肠癌细胞的增殖能力, 细胞划痕实验检测细胞的迁移能力, Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭能力, 免疫共沉淀方法检测TRAF6和TRAF6-331mut与泛素的赖氨酸结合位点K48和K63的泛素化作用, Western blot检测过表达TRAF6和TRAF6-331mut对核因子κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/激活蛋白1(AP-1)信号通路的影响。结果荧光显微镜下观察到病毒成功感染结直肠癌细胞。Western blot检测显示, TRAF6和TRAF6-331mut在结直肠癌细胞中成功表达。CCK-8法检测结果显示, 到第4天, TRAF6-331mut组HCT116和SW480细胞的A值分别为1.89±0.39和1.88±0.24, 均低于TRAF6组(分别为2.09±0.12和2.17±0.45, P值分别为0.036和0.011)。平板克隆形成实验结果显示, TRAF6-331mut组HCT116和SW480细胞的克隆数分别为(120±14)个和(85±14)个, 均低于TRAF6组[分别为(190±21)个和(125±13)个, P值分别为0.001和0.002]。细胞划痕实验结果显示, 48 h后, TRAF6-331mut组HCT116和SW480细胞的伤口愈合距离百分比分别为(31±12)%和(33±14)%, 均低于TRAF6组[分别为(43±13)%和(43±7)%, P值分别为0.005和0.009]。Transwell迁移实验结果显示, TRAF6-331mut组HCT116和SW480细胞的迁移数分别为(104±13)个和(107±12)个, 均低于TRAF6组[分别为(172±19)个和(138±16)个, P值分别为<0.001和0.002]。Transwell侵袭实验结果显示, TRAF6-331mut组HCT116和SW480细胞的穿膜数分别为(103±17)个和(92±13)个, 均低于TRAF6组[分别为(177±20)个和(127±18)个, P值分别为0.008和0.009]。免疫共沉淀法检测结果显示, 在与K48共转染的293T细胞中, 被TRAF6-331mut下拉的K48链泛素蛋白的表达量为0.57±0.19, 低于野生型TRAF6下拉的K48链泛素蛋白的表达量(0.84±0.04, P=0.014);在与K63共转染的293T细胞中, 被TRAF6-331mut下拉的K63链泛素蛋白的表达量为0.31±0.13, 低于野生型TRAF6下拉的K63链泛素蛋白的表达量(0.89±0.08, P<0.001)。Western blot检测显示, TRAF6-331mut-HCT116细胞中NF-κB、p-NF-κB和p-AP-1蛋白表达水平分别为0.63±0.08、0.42±0.08和0.60±0.07, 低于TRAF6-HCT116细胞(均为1.00±0.00, P值分别为0.002、<0.001和<0.001), AP-1蛋白表达水平为0.89±0.06, 与TRAF6-HCT116细胞(1.00±0.00)比较, 差异无统计学意义(P=0.051);TRAF6-331mut-SW480细胞中NF-κB、p-NF-κB和p-AP-1蛋白表达水平分别为0.50±0.06、0.51±0.04和0.48±0.02, 低于TRAF6-SW480细胞(均为1.00±0.00, 均P<0.001), AP-1蛋白表达水平为0.90±0.06, 与TRAF6- SW480细胞(1.00±0.00)比较, 差异无统计学意义(P=0.087)。结论 TRAF6基因第331泛素化位点突变可能阻止了TRAF6与泛素赖氨酸位点K48和K63的结合, 进而影响下游NF-κB和MAPKs/AP-1信号通路相关蛋白的表达, 抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
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单位福建医科大学附属第一医院
