科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
目的：探讨低氧诱导的长链非编码核内小RNA宿主基因14(long non-coding small nucleolar RNA host gene 14,lncRNA SNHG14)在胶质瘤替莫唑胺(temozolomide,TMZ)耐药中的作用和潜在机制。方法：根据不同处理将实验分为常氧组、低氧组、对照组(NC组)和TMZ组，利用real-time PCR和蛋白质印迹法分别检测胶质瘤细胞SNB19和U251中lncRNA SNHG14和O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)的表达水平，分析lncRNA SNHG14表达水平与低氧和TMZ处理的关系。利用siRNA干扰胶质瘤细胞中lncRNA SNHG14表达，将转染后的胶质瘤细胞分为si-对照组(si-NC组)和si-SNHG14组，利用real-time PCR检测干扰效率，并采用蛋白质印迹法检测TMZ敏感性调控关键因子MGMT的表达变化，采用流式细胞术检测细胞凋亡；此外，增设常氧组和低氧组，应用MTT法检测不同TMZ浓度梯度下各组胶质瘤的细胞活性，分析lncRNA SNHG14对胶质瘤TMZ敏感性的影响。利用在线工具针对性地预测与lncRNA SNHG14和MGMT结合的miRNAs。应用realtime PCR观察不同环境下si-NC组、si-SNHG14组、常氧组和低氧组miR-143的丰度变化。利用miR-143拟似剂(mimics)和抑制剂(inhibitor)改变胶质瘤细胞中miR-143水平，将实验设置为NC inhibitor组、miR-143 inhibitor组、NC mimics组和miR-143 mimics组，采用real-time PCR检测干扰效率，应用蛋白质印迹法检测MGMT的表达水平，分析miR-143对MGMT水平的影响。对NC inhibitor组、miR-143 inhibitor组、NC mimics组和miR-143 mimics组进行不同干预，采用双荧光素酶报告实验观察lncRNA SNHG14和MGMT荧光素酶的活性变化，验证lncRNA SNHG14、miR-143和MGMT之间的靶向调控关系。最后，设置NC组和lncRNA SNHG14过表达组，通过RNA结合蛋白免疫沉淀实验检测各组中miR-143和MGMT的丰度变化，分析lncRNA SNHG14、miR-143和MGMT间的竞争结合关系。结果：与常氧组相比，低氧组可以促进胶质瘤细胞中lncRNA SNHG14表达；与NC组相比，TMZ组能显著抑制lncRNA SNHG14的表达(均P<0.05)。与si-NC组相比，si-SNHG14组可有效抑制lncRNA SNHG14表达，且MGMT表达水平呈现显著下降，细胞凋亡率显著升高(均P<0.05)。随着TMZ浓度的升高，si-SNHG14组胶质瘤细胞活力显著低于si-NC组，低氧组的细胞活力显著高于常氧组(均P<0.05)。在线工具预测发现：miR-143与lncRNA SNHG14和MGMT存在结合位点，低氧组miR-143丰度显著低于常氧组，si-SNHG14组miR-143丰度显著高于si-NC组(均P<0.05)。miR-143 mimics组或miR-143 inhibitor组可显著过表达或低表达miR-143(均P<0.05)，但NC mimics组或NC inhibitor组与NC组相比，差异均无统计学意义(均P>0.05);miR-143 inhibitor组MGMT蛋白水平显著上调(P<0.01),miR-143 mimics组则反之(P<0.01)。双荧光素酶报告实验显示：NC mimics组或NC inhibitor组与各自的对照组相比，差异均无统计学意义(均P>0.05);miR-143 mimics组野生型SNHG14和MGMT的荧光素酶活性显著下调，而miR-143 inhibitor组野生型SNHG14和MGMT的荧光素酶活性显著上调(分别P<0.01和P<0.05)；但突变型SNHG14和MGMT的荧光素酶活性均无明显变化(均P>0.05)。RNA结合蛋白免疫沉淀实验结果显示：与NC组相比，过表达lncRNA SNHG14组细胞中沉淀的argonaute 2蛋白上结合有更多的lncRNA SNHG14，但MGMT mRNA丰度却出现显著下降，差异均有统计学意义(均P<0.01),lncRNA SNHG14、miR-143和MGMT之间存在靶向调控关系。结论：低氧下胶质瘤细胞中表达上调的lncRNA SNHG14靶向miR-143，解除miR-143对MGMT的抑制，从而促进胶质瘤细胞产生TMZ耐药。
-
单位中南大学湘雅医院; 神经内科
