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摘要
目的克隆屋尘螨Der p23基因,表达和纯化目的蛋白并进行过敏原性分析。方法提取屋尘螨总RNA,对Der p23基因进行RT-PCR(逆转录酶聚合酶链反应)扩增,经限制性内切酶双酶切,酶切产物与表达载体pET-32a(+)重组,转化入感受态大肠埃希菌溶液中。挑取阳性单克隆菌落进行扩大培养,提取目的蛋白并进行Ni2+柱亲和层析纯化,通过Western blot检测其过敏原性。通过BLAST、MEGA、SWISS-MODEL分析重组蛋白Der p23的同源性和三级结构。结果 Der p23基因片段大小约为282bp。大量表达后,SDS-PAGE电泳显示,纯化的重组蛋白Der p23的分子质量单位约为32ku,且以包涵体的形式存在于沉淀物中。Western blot显示该重组蛋白可与尘螨过敏患者血清发生反应,表明其具有过敏原性。BLAST和MEGA分析,Der p23与Der f23的氨基酸序列同源性为77%。Der p23蛋白二级结构主要有β折叠和转角结构,从中预测出5个抗原表位。结论克隆表达和纯化获得了具有过敏原性的Der p23蛋白,为尘螨过敏疫苗和诊断试剂的研制奠定了理论基础。
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