突变质粒CMV-3flag-hPROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)的构建及表达

作者：周晓涛; 周文涛; 彭震; 刘化蝶; 陈丹娜; 夏开德; 迪丽娜尔·波拉提; 赵云娟; 李家大

来源：生物技术, 2018, 28(02): 113-150.

DOI：10.16519/j.cnki.1004-311x.2018.02.0021

• hPROKR2
• 连续多位点碱基突变
• 限制性内切酶NotⅠ
• 质粒构建

[目的]构建CMV-3flag-h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)真核表达质粒并观察其蛋白表达。[方法]将NotⅠ的酶切位点(GCGGCCGCC)引入第一次PCR的后引物,扩增并突变h PROKR2的1-1035 bp(343YFK/AAA345),再将NotⅠ的酶切位点和3个连续甘氨酸突变碱基GCCGCCGCA引入第二次PCR的前引物扩增并突变h PROKR2的1036-1152bp(351HWR/AAA353),通过NotⅠ酶切位点连接前后两个片段,即可构建pc DNA3.1-h PROKR2-myc-his(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353),最后通过测序鉴定突变是否成功。扩增h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353),连接入CMV-3flag。Western Blot检测相应蛋白的表达。[结果]成功构建CMV-3flag-h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)质粒,并验证到相应蛋白表达。[结论]利用NotⅠ酶的碱基序列特性(GCGGCCGCC)进行3个连续氨基酸突变的方法简单有效。质粒CMV-3flag-h PROKR2(343YFK/AAA345,351HWR/AAA353)的成功构建为后期进一步实验创造条件。

• 单位
  新疆医科大学第五附属医院; 中南大学; 基础医学院; 新疆医科大学; 医学遗传学国家重点实验室