多聚磷酸盐激酶的原核表达、纯化及酶活性测定

作者：曾李婷; 肖仪; 彭亮^*

来源：中国生物制品学杂志, 2020, 33(05): 493-497.

DOI：10.13200/j.cnki.cjb.003047

• 多聚磷酸盐激酶
• 基因重组
• 蛋白表达
• 酶活性

目的原核表达、纯化多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase,PPK),并检测其酶活性。方法采用PCR法从尿路致病性E. coli CFT073中扩增ppk基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-ppk,转化感受态E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。重组蛋白经His-镍亲和层析柱分离纯化后,采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色法测定纯化蛋白的酶活性。结果重组表达质粒pET-28a-ppk经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。重组蛋白的相对分子质量约80 000,纯化后蛋白浓度为518. 9μg/mL。在加入10μg PPK酶,37℃孵育30 min的条件下测得的PPK酶活性最大,为(645. 16±32. 98)U/mg。结论成功在E. coli中表达了重组PPK,纯化产物纯度较高,具有PPK酶活性,为后续以PPK为靶点新型抗菌药物的研发奠定了基础。

• 单位
  广州医科大学附属第五医院