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摘要
目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对乳鼠心房肌细胞(NRIC)钙超载的作用及其机制。方法分离出生1～3d的SD大鼠NRIC。NRIC接种后第3天分成以下几组:(1)对照组(不做任何处理);(2)Hcy不同浓度组:NRIC中分别加入终浓度为50、100、200、500μmol/L的Hcy培养48h;(3)抗氧化剂(NAC)组:NRIC中加入10μmol/L NAC培养24 h;(4)Hcy+NAC组:NRIC中加入终浓度为500μmol/L的Hcy培养48h,然后加入10μmol/L NAC培养24 h;(5)钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡδ)抑制剂(KN-93)组:NRIC加入3μmol/L的KN-93孵育5 h;(6)特异性钠电流抑制剂(ELE):NRIC中加入1μmol/L的ELE孵育5 h;(7)Hcy+KN-93组:NRIC加入终浓度为500μmol/L的Hcy培养48 h,然后加入3μmol/L的KN-93孵育5 h;(8)Hcy+ELE组:NRIC中加入终浓度为500μmol/L的Hcy培养48h,后加入1μmol/L的ELE孵育5 h;(9)Hcy+KN-93+ELE组:NRIC中加入终浓度为500μmol/L的Hcy培养48 h,然后加入3μmol/L的KN-93和1μmol/L的ELE孵育5 h。慢病毒感染NRIC的分组及其干预:将NRIC以2×106个细胞/ml的密度接种于6孔板,培养48 h至细胞融合度达70%～80%。将包装的慢病毒载体原液加入完全培养基中,分别组成CaMKⅡδ-siRNA组和Nav1.5-siRNA组。阴性感染组仅加入含绿色荧光蛋白(GFP)的阴性慢病毒载体原液。3组MOI值均为10,感染24h。在倒置荧光显微镜下观察感染后24 h各组细胞GFP荧光百分比,判断慢病毒感染效率,定期传代并进行Puro筛选,培养扩增稳转细胞,在构建成功的慢病毒干扰组的基础上加入Hcy处理,并分为Hcy+CaMKⅡδ-siRNA组、Hcy+Nav1.5-siRNA组和Hcy+阴性感染组3组。采用Fluo-4/AM荧光探针检测NRIC内Ca2+浓度([Ca2+]i)。采用以2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)作为探针,用流式细胞仪检测NRIC内活性氧(ROS),硫代巴比妥酸比色法检测丙二醛(MDA)和黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力。Western blot法和实时荧光定量PCR法分别检测NRIC中CaMKⅡδ和Nav1.5蛋白和mRNA的表达水平。结果(1)各组NRIC内ROS水平和MDA、SOD活力:Hcy 50、100、200和500μmol/L组NRIC内ROS水平和MDA活力均明显高于对照组(P均<0.05),SOD活力则均明显低于对照组(P均<0.05),且均呈现一定的浓度依赖性。另外,NAC组NRIC内ROS水平与对照组比较差异无统计学意义。(2)各组NRIC[Ca2+]i:Hcy 50、100、200和500μmol/L组NRIC[Ca2+]i分别为(155.57±7.25)、(187.43±13.07)、(248.98±27.22)和(307.36±15.09)nmol/L,其中Hcy 500μmol/L组明显高于对照组[123.18±7.24)nmol/L,P<0.01]。另外,Hcy+NAC组NRIC[Ca2+]i明显低于Hcy 500μmol/L组[(222.87±23.71)nmol/L比(305.15±39.45)nmol/L,P<0.05],NAC组与对照组比较差异则无统计学意义。(3)各组NRIC内CaMKⅡδ和Nav 1.5蛋白表达:Hcy 50、100、200和500μmol/L组NRIC内CaMKⅡδ和Nav1.5蛋白表达水平均高于对照组,且后3组差异均有统计学意义(P均<0.01),Hcy对NRIC内CaMKⅡδ和Nav1.5蛋白表达水平的影响呈现一定的浓度依赖性。另外,NAC组NRIC内CaMKⅡδ-Thr287蛋白表达水平明显低于Hcy 500μmol/L组(P<0.01),NAC组与对照组NRIC内CaMKⅡδ-Thr287和Nav1.5蛋白表达水平差异均无统计学意义。(4)各组NRIC内CaMKⅡδ-Thr287蛋白表达水平和[Ca2+]i:Hcy+KN-93组和Hcy+KN-93+ELE组NRIC内CaMKⅡδ-Thr287蛋白表达水平均明显低于Hcy 500μmol/L组(P均<0.05),且以Hcy+KN-93+ELE组为甚,Hcy+ELE组亦低于Hcy 500μmol/L组,但差异无统计学意义。Hcy+KN-93组、Hcy+ELE组和KN-93+ELE+Hcy组NRIC[Ca2+]i均明显低于Hcy 500μmol/L(P均<0.05),且以KN-93+ELE+Hcy组为甚。(5)慢病毒感染各组NRIC内CaMKⅡδ、Nav1.5蛋白和mRNA表达:慢病毒感染NRIC 24 h时GFP表达最理想(可达90%),CaMKⅡδ-siRNA组和Nav1.5-siRNA组NRIC内CaMKⅡδ、Nav1.5蛋白和mRNA表达水平均明显低于阴性感染组(P均<0.05),而阴性感染组与对照组比较差异则均无统计学意义。另外,Hcy+Nav1.5-siRNA组NRIC内CaMKⅡδ-Thr287和CaMKⅡδ蛋白以及mRNA表达水平均明显低于Hcy+阴性感染组(P均<0.05),Hcy+CaMKⅡδ-siRNA组与Hcy+阴性感染组比较Nav1.5蛋白和mRNA水平差异则均无统计学意义。结论高Hcy可诱导NRIC内钙超载,其机制可能为高Hcy使机体处于高氧化应激状态,通过上调钠通道蛋白,激活晚钠电流,并磷酸化CaMKⅡδ,从而共同引起钙超载。
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