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摘要
目的观察胃癌细胞株MKN-28、MKN-45、SGC-7901外泌体(exosome)对CD8+T细胞周期、细胞凋亡、细胞因子分泌及基因表达的影响。方法从外周血中通过密度梯度离心法及免疫磁珠法分离CD8+T细胞,超速离心法获得SGC-7901、MKN-45、MKN-28细胞株的exosome,将exosome与CD8+T细胞以不同浓度共培养48 h,收集CD8+T细胞,采用流式细胞术检测细胞周期,膜联蛋白V/碘化丙锭(Annexin V/PI)染色法检测细胞凋亡,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子表达水平,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法检测基因表达水平。结果在MKN-28、MKN-45、SGC-7901上清液中分离exosome,并表达分子表面标志物ALG-2相互作用蛋白X(Alix)及肿瘤易感基因101(TSG101)。在外周血单个核细胞(PBMC)中分离出了CD8+T细胞,纯度达98%。MKN-28 exosome对细胞凋亡的作用呈剂量依赖。3种胃癌细胞株exosome对CD8+T细胞周期均有影响(P<0.05),但不同细胞株exosome对CD8+T细胞周期作用不同。100 mg/L MKN-45 exosome刺激的CD8+T细胞可分泌白细胞介素(IL)-2、IL-6、IL-10、γ-干扰素(IFN-γ)[(305.44±42.07) ng/L比(129.89±11.07) ng/L,P<0.01;(344.39±25.34) ng/L比(149.67±15.23) ng/L,P<0.01;(413.31±38.76) ng/L比(35.19±24.95) ng/L,P<0.01;(303.78±44.98) ng/L比(277.67±40.66) ng/L,P<0.05]。100 mg/L SGC-7901 exosome可刺激CD8+T细胞分泌IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ[(318.61±41.56) ng/L比(238.89±35.84) ng/L,P<0.05;(501.06±55.05) ng/L比(149.67±15.23) ng/L,P<0.01;(486.75±71.20) ng/L比(35.19±24.95) ng/L,P<0.01;(621.00±55.14) ng/L比(277.67±40.66) ng/L,P<0.01]。100 mg/L MKN-28 exosome可刺激CD8+T细胞分泌IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ[(411.56±48.62) ng/L比(129.89±11.07) ng/L,P<0.01;(403.83±52.29) ng/L比(149.67±15.23) ng/L,P<0.01;(678.31±78.02) ng/L比(35.19±24.95) ng/L,P<0.01;(751.88±63.16) ng/L比(277.67±40.66) ng/L,P<0.01]。经100 mg/L MKN-28 exosome刺激的CD8+T细胞分泌的IL-10表达倍数为对照组19.53倍。MKN-45 exosome可刺激CD8+T细胞表达叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3)、IL-10、IFN-γ、第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因(PTEN)、信号转导与转录激活因子-3(STAT3)(3.46±0.39比1.00±0.09,P<0.01;3.29±0.39比1.01±0.16,P<0.01;2.24±0.30比1.00±0.06,P<0.01;2.14±0.12比1.00±0.08,P<0.05;1.24±0.12比1.00±0.07,P<0.05)。SGC-7901 exosome可刺激CD8+T细胞表达脱中胚蛋白(Eomes)、Foxp3、IL-10、IFN-γ、信号淋巴细胞激活分子4(2B4)、分化簇160(CD160)、GATA结合蛋白3(GATA3)、STAT3、PTEN(2.35±0.17比1.01±0.13,P<0.01;3.19±0.21比1.00±0.09,P<0.01;2.38±0.31比1.01±0.16,P<0.01;5.44±0.71比1.00±0.06,P<0.01;3.20±0.31比1.00±0.12,P<0.01;3.19±0.13比1.01±0.16,P<0.01;1.35±0.17比1.00±0.07,P<0.01;1.44±0.18比1.00±0.07,P<0.05;1.31±0.15比1.00±0.08,P<0.05)。MKN-28 exosome可刺激CD8+T细胞表达Eomes、Foxp3、IL-10、IFN-γ、STAT3、PTEN、CD160、2B4(3.36±0.18比1.01±0.13,P<0.01;4.35±0.30比1.00±0.09,P<0.01;5.40±0.63比1.01±0.16,P<0.01;6.43±0.84比1.00±0.06,P<0.01;1.54±0.28比1.00±0.07,P<0.05;0.78±0.11比1.00±0.08,P<0.05;1.68±0.42比1.01±0.16,P<0.05;1.31±0.22比1.01±0.12,P<0.05)。经MKN-28 exosome刺激的CD8+T细胞基因较对照组及另外两组细胞株表达量增加,如Foxp3、IL-10、IFN-γ。结论胃癌exosome可诱导CD8+T细胞凋亡,改变基因表达和细胞因子分泌。但在这些过程中,负性调节分子在各组间的差异更大,可能是胃癌细胞exosome与CD8+T细胞相互作用,抑制其发挥免疫功能,致使肿瘤免疫逃逸。
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单位苏州大学; 苏州大学附属第三医院
