科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
SpyTag/SpyCatcher环化技术是一种自发迅速的共价连接反应,通过环化蛋白的骨架以实现目标蛋白的环化,从而提高目标蛋白稳定性。研究显示,SpyTag/SpyCatcher技术介导的环化过程不受环境的影响,不会影响目标蛋白原本的催化活性和功能,且一旦完成便具有极强的稳定性。小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifiers, SUMOs)是一种十分有效的促溶标签,广泛应用于重组蛋白的原核表达过程中。泛素样特异蛋白酶1 (ubiquitin-like-specific protease 1, Ulp1)是SUMO特异性蛋白酶中的一个重要成员,具有将SUMO从目标融合蛋白上切下,不残留任何氨基酸碱基的特异性酶切活性,且参与SUMO的成熟过程,但较差的稳定性限制了其应用。本研究使用截断型Ulp1 (Gly304～Lys621)代替全长Ulp1,并对其序列进行了优化,得到了重组截断型Ulp1。重组截断型Ulp1既具有Ulp1全部的酶活性,又能更好地在大肠杆菌(Escherichia coli)中高效表达。本研究设计并表达了重组截断型(recombinant truncated Ulp1-His6, rt Ulp1)、Spy Tag-rt Ulp1-Spy Catcher-His6 (crt Ulp1)和Spy-TagΔDA-rt Ulp1-Spy CatcherΔEQ-His6(lrt Ulp1)三种蛋白酶。综合比较3种蛋白酶的最适反应条件以及热稳定性,结果显示,crt Ulp1的最佳反应酶切温度比lrt Ulp1高10℃,比rt Ulp1高5℃。crt Ulp1在40℃条件下孵育2 h后仍保留87.3%的相对酶活,lrt Ulp1在40℃条件下孵育2 h后仍保留43.69%的相对酶活,而rt Ulp1几乎丧失了全部的酶活。且crt Ulp1在广泛的酸碱范围内都能保持较高的酶活,而rt Ulp1与lrt Ulp1只在其最佳反应p H下表现出较高的酶切活性。本研究利用Spy Tag/Spy Catcher技术获得了高稳定性的rt Ulp1,评价了环化结构对rt Ulp1热稳定性的影响以及Spy Tag/Spy Catcher技术对rt Ulp1热稳定性提高的效果,为获得具有高热稳定性的SUMOs特异性蛋白酶及促溶标签SUMOs的广泛使用提供技术基础。
-
单位农业部; 河南农业大学
