摘要

目的构建大鼠基质金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)的真核表达载体pTIMP-1,并在中国仓鼠卵母(CHO)细胞中表达。方法从大鼠肝组织提取总RNA,RT-PCR扩增出TIMP-1基因的cDNA片段,将目的片断克隆至pMD18-T载体,酶切和测序鉴定,然后将目的片断酶切回收后插入pcDNA3.1,构建真核表达载体pTIMP-1,将该载体转染到CHO细胞后24~48 h,收集细胞上清同时制作细胞爬片,双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫组化检测TIMP-1的表达情况。结果扩增出了长约654 bp的基因片段,并将其克隆至pMD18-T载体,酶切和测序鉴定无误;将pMD-TIMP-1中TIMP-1基因亚克隆至pcDNA3.1载体,酶切鉴定无误;pTIMP-1载体转染CHO细胞后,ELISA法可检测到细胞上清中有大量TIMP-1的表达,同时细胞爬片免疫组织化学染色可见胞浆中存在明显的阳性棕染。结论成功构建了大鼠TIMP-1基因的真核表达载体pTIMP-1,为进一步探讨其功能奠定了实验基础。