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摘要
利用脂肪酸脱羧制备烃类生物燃料是开发可再生能源的有效途径.相比于传统化学法,生物酶法具备高效、能耗低及环境友好等优势,更具有工业应用前景.光脱羧酶(FAP)是一类专一性强,催化效率高,催化过程无需额外添加昂贵辅因子,仅需利用蓝光即可将脂肪酸转化为烷(烯)烃的光驱动酶,在烃类生物燃料的高效可持续生物合成领域具有应用潜力.目前已报道的有偏好催化C12-C20链长脂肪酸的光脱羧酶,但其底物选择性机制尚未被深入探究.本文挖掘了来源于绿藻Micractiniumconductrix的光脱羧酶McFAP,并开展了异源表达及制备、酶学性质表征、催化特性及底物选择性机制等研究.利用全基因合成技术获得了来源于绿藻Micractinium conductrix假定的光脱羧酶基因序列mcfap,同时构建了N端缺失突变体McFAP-S(缺失1-550位氨基酸).在大肠杆菌中实现了McFAP-S的异源表达.重组的McFAP-S对链长为6-18的饱和直链脂肪酸均有脱羧活性,偏好中链脂肪酸,最适底物为正辛酸(C8:0)(转化率＞99％).相同条件下,McFAP全细胞催化软脂酸(C16:0)脱羧的转化率是CvFAP(来源于Chlorellavariabilis)的1.7倍.重组的McFAP-S催化正辛酸脱羧的最适反应温度为40℃,孵育6 h后残余酶活力为70.2％;最适pH值为8.0,孵育5 d后残余酶活力为65.4％;对甲醇,DMSO等有机溶剂及Ni2+,Ca2+等金属离子具有良好的耐受性;4℃避光条件下储存10 d残余酶活力为76.7％.考察了不同波长光对McFAP-S酶活力的影响,结果表明,红光照射3 h后McFAP-S残余酶活力为97.2％;在可见光照射下McFAP-S与正辛酸共孵育3 h后残余酶活力＞99％.McFAP-S在30℃,pH 9.0,加酶量为60μmolL-1的条件下催化正辛酸脱羧,反应30 min后转化率为95.3％.构建了McFAP-S三维结构模型,通过与CvFAP的三维结构对比分析,推测底物通道口大小对McFAP-S底物选择性有重要影响,根据二者对不同链长底物结合位置的区别,设计了突变体S338V,S338L,S338A,L339I,T340A,T340S,McFAP-S338A/L339I/T340S及A344-347.结果表明,S338L仅保留催化软脂酸脱羧活力(是野生型的3.7％);L339I对正庚酸(C7:0)脱羧活力相较于野生型降低了 15％,对月桂酸(C12:0)脱羧活力增加了28％;T340S对正己酸(C6:0)脱羧活力降低了67％;S338A/L339I/T340S对正己酸脱羧活力降低了78％.以上表明,S338,L339,T340可能是参与该酶底物选择性调控的关键位点.综上所述,相较已报道的CvFAP催化特性,McFAP具有偏好中链脂肪酸和脱羧活性更高等优势,提高光脱羧酶催化中链脂肪酸脱羧生成C5-C12烷烃的效率,同时本研究初步阐明了McFAP的底物选择性机制,可为光脱羧酶的研发及应用提供借鉴,为阐明光脱羧酶的结构功能关系研究提供一定的基础.
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