应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白的反式激活基因

作者：王春花; 成军; 吴煜; 杨艳杰; 张黎颖; 党晓燕; 郎振为

来源：胃肠病学和肝病学杂志, 2004, (01): 20-23.

• 抑制性消减杂交
• 末端蛋白
• 反式激活

目的　应用抑制性消减杂交 (SSH)技术构建乙型肝炎病毒 (HBV)DNA聚合酶末端蛋白 (TP)反式激活基因的差异表达的cDNA消减文库 ,克隆TP反式激活相关基因。方法　以TP表达质粒pcDNA3 .1(-) TP转染HepG2细胞 ,以空载休pcDNA3 .1(-)为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果　文库扩增后得到 3 5个阳性克隆 ,经菌落聚合酶链反应 (PCR)分析 ,得到 3 4个 2 0 0～ 10 0 0bp插入片段。对所得片段测序 ,并进行同源性分析 ,显示 14种己知基因编码蛋白和 1种未加功能基因序列 ,可能是TP反式激活靶基因。结论　成功构建乙型肝炎病毒TP反式激活基因差异发达的cDNA消减文库 ,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础

• 单位
  解放军第302医院