稀释剂种类和冻融次数对质粒标准品实时荧光定量PCR检测的影响

作者：雷杰; 牛群; 王楠; 杨瑜; 谢贝; 刘志辉; 孟繁荣^*

来源：国际医药卫生导报, 2019, 25(10): 1521-1525.

• 冻融
• 稀释剂
• 质粒标准品
• 实时荧光定量PCR

目的探讨稀释剂种类和冻融次数这两种因素对实时荧光定量PCR检测中质粒标准品的影响。方法分别采用ddH2O和TE缓冲液两种稀释剂将质粒标准品稀释为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104拷贝/μl的5个浓度检测液各5份, 在冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次之后进行实时荧光定量PCR检测, 比较其Ct值。结果①浓度1×108、1×107、1×106、1×105、1×104拷贝/μl时, 冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次之后, 质粒标准品在ddH2O和TE缓冲液两种稀释剂中, 实时荧光定量PCR检测Ct值中位数分别为17.46和17.32(P>0.05), 23.52和23.61(P>0.05), 26.77和26.37(P>0.05), 32.73和30.88(P<0.05), 33.08和31.51(P<0.05)。②冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次, 在ddH2O和TE缓冲液中, 各浓度标准品Ct值中位数分别如下:1×108拷贝/μl:17.43、17.56、17.45、17.45、17.26、17.94(P>0.05)和17.38、17.36、17.47、17.31、17.30、17.62(P>0.05);1×107拷贝/μl:22.17、23.16、24.12、23.51、23.94、23.89(P<0.05)和22.40、24.09、24.07、23.54、23.68、24.05(P<0.05);1×106拷贝/μl:24.66、25.27、26.66、27.29、27.78、27.40(P<0.05)和24.92、26.22、26.31、26.59、26.93、26.53(P<0.05);1×105拷贝/μl :29.25、30.66、32.72、32.84、33.27、33.39(P<0.05)和29.21、30.10、30.97、30.87、31.72、32.44(P<0.05);1×104拷贝/μl:31.05、30.50、32.99、33.21、33.59、33.41(P<0.05)和31.22、31.28、31.49、31.52、32.37、32.31(P<0.05)。结论相对于ddH2O, 质粒标准品选择用TE缓冲液作为稀释剂更稳定。质粒标准品随着冻融次数增多, 其稳定性越差, 因此要避免反复冻融质粒标准品。

• 单位
  广州市胸科医院; 呼吸疾病国家重点实验室