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摘要
目的 目前关于膀胱过度活动症(OAB)发病机制的研究主要集中在逼尿肌受体的异常,已证实β肾上腺素能受体(β-AR)能够介导膀胱平滑肌松弛,对维持储尿过程中膀胱良好的顺应性起着关键作用,阐明β-AR三种亚型与逼尿肌松弛的关系及起主要作用的β3-AR基因突变与OAB的关系具有重要意义。通过RNAi技术,封闭β肾上腺素能受体亚型中的两个,获得表达单一β-AR亚型的逼尿肌细胞,借助异丙肾上腺(ISO)激活各单一亚型逼尿肌细胞,检测胞内cAMP表达水平,以确定松弛膀胱逼尿肌的主要β肾上腺素能受体亚型。通过对比分析OAB病例与正常对照组之间β3-AR的Trp64ArgSNP的基因突变率和基因型,以及存在此突变的β3-AROAB病例与其他对照组在不同浓度ISO激活下cAMP表达水平的比较,明确此β3-AR基因突变是OAB发生及治疗耐药的一个原因。 方法 1.研究对象 293FT细胞购自Invitrogen公司;DMEM培养基;100mg/L氨苄青霉素、50mg/L链霉素;10%胎牛血清(四季青公司);PBS(磷酸盐缓冲溶液);胰酶/EDTA消化液;Lipofecter脂质体转染试剂;β1-PGS质粒、β2-PGS质粒和β3-PGS质粒。选取临床尿动力学检测证实为逼尿肌不稳定病例20名(存在膀胱充盈期出现大于15cmH2O的逼尿肌期相性收缩)和10名正常对照,内切酶采用限制性内切酶BstNI(酶切位点CC↓(A/T)GC)。 2.脂质体转染逼尿肌细胞 采用293FT细胞系传代培养,构建各受体亚型转染脂质体,在1mL无血清DMEM中分别稀释β1-PGS质粒和β2-PGS质粒;旋转1秒钟,再加入β1-PGS质粒和β2-PGS质粒——脂质体悬液,旋转;室温下放置10分钟,使β1-PGS质粒和β2-PGS质粒结合在脂质体上。在装有培养的逼尿肌细胞每孔中加入含20%FCS的DMEM,继续培养24小时,吸出DMEM-β1-PGS质粒和β2-PGS质粒——脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM,2ml/孔,再培养48小时。用消化法收集细胞。 3.正常传代逼尿肌细胞与转染后细胞的β-AR受体表达RT-PCR法鉴定 首先提取正常传代逼尿肌细胞与转染后细胞中总RNA,然后根据Genebank提供的三种β-AR基因序列(NM_000024)采用Olig06.6软件设计引物,扩增目的基因。 引物序列如下: β1-AR 正义引物:5'-CGGGCAATGTGCTGGTGA-3' 反义引物:3'-GGAAGGCGATGGTCTCGGAC-5' 反应产物长度:287bp β2-AR 正义引物:5'-GAGCCTGCTGACCAAGA-3' 反义引物:3'CAATCCGTAGTAGTACCC-5' 反应产物长度:414bp β3-AR 正义引物:5'-GCCTTCGCCTCCAACAT-3' 反义引物:3'-TCCAATACGGTTAAGACGG-5' 反应产物长度:415bp beta-actin序列如下: 正义引物:5'-TAGTTGCGTTACACCCTTTC-3' 反义引物:3'-CCTTGCCACTTCCACTGT-5' 反应产物长度:187bp RT-PCR扩增β-AR全长cDNA,自动电泳凝胶成像分析仪分析结果。 4.正常传代逼尿肌细胞与转染后细胞的β-AR受体表达免疫蛋白印迹杂交法鉴定 将培养皿中的培养液收集在15ml离心管中,用细胞刮子刮除生长在皿底的细胞,在室温条件下用PBS冲洗后也收集在同一离心管中。进行SDS-PAGE电泳,将电泳后的胶取出浸入转移缓冲液中,将凝胶贴于PVDF膜上,杂交后进行化学发光反应,将胶片放入自动电泳凝胶成像分析仪进行数据分析。 5.异丙肾上腺素对β肾上腺素能受体单一亚型细胞克隆cAMP水平的影响 将原代培养的膀胱逼尿肌细胞,空载体转染的逼尿肌细胞和经过鉴定的β肾上腺素能受体单一基因亚型细胞克隆分别加入100μl异丙肾上腺素(4个浓度组一10-7、10-8、10-9、10-10mol/L),用超声细胞破碎仪破碎细胞(30s×5次),12000r/mIn4℃离心10min,然后分别吸取上清液留用。cAMP的测定按cAMP放射免疫试剂盒说明书进行。 6.对比分析OAB与对照组β3-AR的Trp64ArgSNP基因型及突变率 用DNA提取试剂盒提取DNA,进行PCR。 引物一:CGCCCAATACCGCCAACAC 引物二:CCACCAGGAGTCCCATCACC 酶切反应体系:PCR产物10微升;0.5微升BstN1;2微升10乘Buffer;100乘BSA0.2微升;水7.3微升;条件:60度水浴消化3个小时。2%琼脂糖凝胶电泳,条件为80V,60～90分钟,至溴酚蓝前沿走至胶底部。自动电泳凝胶成像分析仪分析结果。 7.对比分析β3-AR的Trp64A玛SNP与其引起的cAMP表达水平的关系 将经过鉴定仅表达β3肾上腺素能受体亚型的细胞克隆按OAB组存在β3-AR的Trp64ArgSNP、OAB组野生型β3-AR和对照组野生型β3-AR分别加入100μl异丙肾上腺素(4个浓度组-10-7、10-8、10-9、10-10mol/L),用超声细胞破碎仪破碎细胞(30s×5次),12000r/mIn4℃离心10min,然后分别吸取上清液留用。cAMP的测定按cAMP放射免疫试剂盒说明书进行。 结果 1.RT-PCR鉴定脂质体转染逼尿肌细胞结果 电泳结果显示:与空载体转染的逼尿肌及未被转染的正常传代的逼尿肌细胞相比,β1-AR、β2-AR和β3-AR干涉分子转染逼尿肌细胞中β1-AR、β2-AR和β2-AR mRNA表达显著减少,β-actin mRNA表达无显著差异,说明RNAi对β1-AR、β2-AR和β3-ARmRNA表达抑制是特异性的。光密度扫描结果显示pGC-β1-Ari转染细胞与未转染细胞相比β1-AR mRNA表达抑制率可达74%,pGC-β2-Ari转染细胞与未转染细胞相比β2-AR mRNA表达抑制率可达81%,pGC-β3-ARi转染细胞与未转染细胞相比β3-AR mRNA表达抑制率可达77%。 2.蛋白印记杂交鉴定脂质体转染逼尿肌细胞的结果 通过Western蛋白印迹检测了β-AR蛋白表达的变化,蛋白电泳结果显示:与空载体转染的逼尿肌及未被转染的正常传代的逼尿肌细胞相比,β1-AR、β2-AR和β3-AR干涉分子转染的细胞中蛋白表达水平显著下降,而β-actin蛋白表达无显著差异,说明RNAi抑制β-AR蛋白的表达是特异性的。光密度扫描结果显示pGC-β1-Ari、pGC-β2-Ari和pGC-β3-Ari的抑制率分别为81%、87%和85%。 3.各β-AR亚型逼尿肌细胞在不同ISO浓度下cAMP表达水平的比较结果。 细胞内cAMP水平在异丙肾上腺素(10-10～10-7mol/L)作用下呈剂量依赖性升高,当异丙肾上腺素(ISO)浓度超过10-8mol/L时,可见明显升高cAMP的效应,其差异有统计学意义(X2=3.99,p=0.042),最大作用见于10-7mol/L。Β1、β2、β3三种基因亚型的逼尿肌细胞产生了不同的cAMP水平,而且在ISO各个浓度(10-7、10-8、10-9、10-10mol/L)β3-AR亚型的逼尿肌细胞产生的cAMP水平最高(X2=6.34,p=0.012)。 4.OAB与对照组β3-AR的Trp64ArgSNP基因型及突变率 OAB组20名病例发生β3-AR的Trp64ArgSNP病例为13名,突变率65%,其中突变纯合子9名,突变率45%;杂合子4名,突变率20%。对照组10名病例发生β3-AR的Trp64ArgSNP病例2名,突变率20%,皆为杂合子。两组突变率差异有显著性差异(X2=5.41,p=0.02)。 5.β3-AR的Trp64ArgSNP与其引起的cAMP表达水平的关系 细胞内cAMP水平在异丙肾上腺素(10-10～10-7mol/L)作用下仍然呈剂量依赖性升高,当异丙肾上腺素(ISO)浓度超过10-8mol/L时,OAB组与对照组中野生型β3-AR病例可见明显升高cAMP的效应,其差异有统计学意义(X2=4.73,p=0.030),而OAB组中Trp64ArgSNP的β3-AR病例升高效应差异无统计学意义(X2=2.12,p=0.146),ISO最大作用见于10-7mol/L。 对比分析在ISO各个浓度(10-7、10-8、10-9、10-10mol/L)下,OAB组Trp64ArgSNP的β3-AR逼尿肌细胞,野生型β3-AR逼尿肌细胞,以及对照组野生型β3-AR逼尿肌细胞的三种细胞产生的cAMP水平,结果表明对照组野生型β3-AR逼尿肌细胞产生的cAMP水平最高,OAB组Trp64ArgSNP的β3-AR胱逼尿肌细胞产生的cAMP水平最低,依据不同浓度绘制的三组cAMP表达水平曲线相比差异有显著性意义。(X2=13.48,P=0.001) 结论 1.借助RT-PCR与免疫蛋白电泳技术证实RNAi对β1-AR、β2-AR和β3-ARmRNA表达抑制是特异性的。 2.cAMP表达水平呈异丙肾上腺素剂量依赖性上升,对比证实β3-AR在介导逼尿肌松弛过程中起着更为主要的作用,而其它两种亚型则起着从属作用。 3.OAB组病例β3-AR的Trp64ArgSNP突变率明显增高,不同ISO浓度下,OAB病例组Trp64ArgSNP的β3-AR和野生型β3-AR逼尿肌细胞表达的cAMP水平均低于对照组野生型β3-AR逼尿肌细胞,OAB病例β3-AR松弛逼尿肌功能障碍与该受体亚型Trp64ArgSNP有关。 4.OAB病例组Trp64ArgSNP的β3-AR逼尿肌细胞的ISO浓度依赖性cAMP表达水平升高的趋势明显低于该组中野生型的β3-AR逼尿肌细胞,β3-AR的Trp64ArgSNP突变是部分OAB病人对肾上腺素能受体激动剂治疗效果不佳的原因。
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