3种药物对苯丙酮尿症PAH基因无义突变的通读效率比较

作者：侯丽青; 侯东霞; 冀云鹏; 朱博; 周燕; 董弘; 刘小霞; 王晓华^*

来源：中华实用诊断与治疗杂志, 2023, 37(08): 802-808.

DOI：10.13507/j.issn.1674-3474.2023.08.010

• 苯丙酮尿症
• 苯丙氨酸羟化酶基因
• 无义突变
• 通读作用
• 慢病毒
• HEK293细胞

目的 构建5个PAH基因无义突变位点慢病毒载体并转染细胞，比较3种不同类型药物PTC124、Amlexanox和G418对PAH基因无义突变的通读效率。方法 选择5个突变频率较高的人PAH基因无义突变位点(R111X、Y166X、R176X、W326X、Y356X)构建慢病毒载体，与野生型慢病毒载体(6个载体均带有Flag标签DDDDK)分别转染HEK293细胞。取野生型(WT)及5种突变型细胞，采用不加药物(0μmol/L)、PTC124(50、100μmol/L)、Amlexanox(250、500μmol/L)、G418(1、2、5 g/L)分别处理48 h,采用CCK-8实验检测72 h细胞增殖率，采用实时荧光定量PCR法检测DDDDK mRNA相对表达量，采用Western blot法检测PAH、DDDDK蛋白相对表达量。结果 (1)WT细胞经5 g/L G418处理72 h后细胞增殖率低于0μmol/L(P<0.05),其余药物及浓度处理后细胞增殖率均不受影响；5种突变型细胞经50、100μmol/L PTC124处理72 h后细胞增殖率均不受影响；W326X、Y356X突变型细胞经500μmol/L Amlexanox处理72 h后细胞增殖率低于0μmol/L(P<0.05),其余突变型细胞经250、500μmol/L Amlexanox处理后细胞增殖率不受影响；R111X、Y166X突变型细胞经5 g/L G418处理72 h后细胞增殖率低于0μmol/L(P<0.05),1、2 g/L G418处理后细胞增殖率不受影响，R176X、W326X和Y356X经1、2、5 g/L G418处理72 h后细胞增殖率均低于0μmol/L(P<0.05)。(2)WT细胞经50、100μmol/L PTC124和250、500μmol/L Amleanox处理后DDDDK mRNA及PAH、DDDDK蛋白相对表达量均高于0μmol/L(P<0.05),5 g/L G418处理后均低于0μmol/L(P<0.05),1、2 g/L G418处理后与0μmol/L比较差异均无统计学意义(P>0.05)。5种突变型细胞经250、500μmol/L Amleanox和5 g/L G418处理后DDDDK mRNA相对表达量均高于0μmol/L(P<0.05),经50、100μmol/L PTC124处理后DDDDK mRNA相对表达量与0μmol/L比较差异均无统计学意义(P>0.05);5种突变型细胞不加药物(0μmol/L)处理后DDDDK mRNA相对表达量均低于WT细胞(P<0.05)。5种突变型细胞经不加药物(0μmol/L)、50、100μmol/L PTC124和250、500μmol/L Amleanox处理后几乎不表达PAH、DDDDK蛋白；R111X、R176X、Y166X、Y356X突变型细胞经5 g/L G418处理后PAH、DDDDK蛋白相对表达量均高于0μmol/L(P<0.05),W326X突变型细胞经1、2、5 g/L G418处理后PAH、DDDDK蛋白相对表达量均高于0μmol/L(P<0.05),1、2 g/L G418均高于5 g/L G418(P<0.05),1 g/L G418与2 g/L G418比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 Amlexanox和G418可提高PAH基因5种无义突变R111X、Y166X、R176X、W326X、Y356X转录水平，其中G418可使5种无义突变表达完整PAH蛋白；G418矫正W326X无义突变的有效浓度为1 g/L,而矫正其余4种无义突变的有效浓度为5 g/L。

• 单位
  内蒙古科技大学包头医学院; 公共卫生学院; 内蒙古自治区妇幼保健院