牛支原体重组蛋白P48原核表达、多克隆抗体制备及间接ELISA抗体检测方法的建立

作者：张妍; 战力源; 姜福洁; 马红霞^*; 孔令聪^*

来源：中国畜牧兽医, 2023, 50(11): 4621-4631.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2023.11.030

• 牛支原体
• P48蛋白
• 间接ELISA

【目的】建立牛支原体抗体间接ELISA检测方法，为牛支原体灭活疫苗的效力检测提供方法。【方法】构建pET-32a-P48原核表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)Plyss感受态细胞筛选阳性质粒并进行双酶切验证，用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达，使用镍柱进行蛋白纯化，经SDS-PAGE验证蛋白纯度及分子质量大小，采用Western blotting检测重组P48蛋白特异性和反应原性；将重组P48蛋白免疫家兔制备多克隆抗体。建立牛支原体间接ELISA抗体检测方法并进行条件优化，确定阴阳性临界值。对建立的方法进行敏感性、稳定性、特异性及与平板凝集试验的符合率试验检测。【结果】经SDS-PAGE验证，P48蛋白分子质量大小为62.68 ku,纯度在90%以上；Western blotting检测结果显示，P48蛋白仅与相应抗体结合呈现单一条带，该蛋白特异性和反应原性良好；琼脂扩散方法测得阳性血清效价为1∶64。建立的间接ELISA检测方法条件优化结果为：抗原包被浓度为0.3μg/mL,1%BSA 37℃封闭120 min,待检血清按1∶1 280稀释，37℃孵育60 min,二抗稀释度为1∶5 000,37℃孵育60 min,邻苯二胺常温显色10 min。结果判定标准为：D492 nm值>0.3196为阳性；D492 nm值<0.3101为阴性；0.3101≤D492 nm值≤0.3196为可疑。敏感性试验结果显示，当阳性样品稀释度为1∶218时，阳性血清判读结果仍为阳性。稳定性试验结果显示，3批次P48蛋白包被的96孔板检测结果的变异系数均<10%;与牛溶血性曼氏海姆杆菌、牛巴氏杆菌阳性血清无交叉反应。本试验建立的间接ELISA抗体检测方法与平板凝集试验阳性血清符合率为100%(18/18),阴性血清符合率为97.5%(39/40)。【结论】本研究建立的牛支原体P48间接ELISA抗体检测方法具有良好的敏感性、特异性及稳定性，为牛支原体抗体检测及牛支原体疫苗效力检测提供了方法。

• 单位
  吉林农业大学