干细胞和软骨细胞共培养用于构建四种无支架软骨的比较

作者：韩絮; 宿广昊; 张亚^*; 胡斌; 王晓东^*

来源：中华实验外科杂志, 2018, 35(08): 1489-1493.

DOI：10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2018.08.031

• 软骨细胞
• 骨髓间充质干细胞
• 共培养
• 无支架
• 组织工程软骨

目的观察4组高数量细胞团无支架离心管内聚集培养体系生成软骨组织的大小和生物学特点并对其进行评价。方法密度梯度离心法分离、培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)。分离、培养兔关节软骨细胞(ACs)。阿利新蓝、蕃红花"O"-亮绿及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定ACs。免疫荧光法鉴定BMSCs表面分子标志CD34、CD44、CD45和CD105。BMSCs和ACs按1:3和2:2的比例混合为共培养(CO)组,聚集共培养于15 ml离心管内。另取等量软骨细胞为AC组,等量BMSCs向ACs诱导转化的BMSCs诱导组(加入转化生长因子-β1的软骨诱导液)作对比研究。4组高数量细胞团分别培养1、2、3、4周后制成石蜡组织切片,阿利新蓝、蕃红花"O"-亮绿、Ⅱ型胶原免疫组织化学和HE染色后镜下观察。阿利新蓝比色法定量检测培养上清液糖胺聚糖(GAG)含量,酶联免疫吸附法(ELISA)定量检测上清液Ⅱ型胶原含量。结果 ACs阿利新蓝、蕃红花"O"-亮绿及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均阳性,BMSCs免疫荧光染色CD34(-)、CD44(+)、CD45(-)、CD105(+);单纯AC组、2:2和1:3共培养组阿利新蓝、蕃红花"O"-亮绿及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均阳性,BM诱导组3个染色弱阳性。HE可见AC组和1:3组软骨细胞逐渐融合成初期软骨组织。2:2和BM诱导组细胞也逐渐整合,但4周后未见软骨雏形形成。4周后AC组[(179.43±59.19)μg/ml]与2:2[(158.06±23.77)μg/ml]、1:3组[(160.06±30.58)μg/ml]的GAG含量比较差异无统计学意义(F=0.210,P=0.812),4周后AC组[(185.13±35.96)ng/ml]与2:2[(169.72±32.56)ng/ml]、1:3[(148.91±33.16)ng/ml]Ⅱ型胶原含量比较差异无统计学意义(F=0.680,P=0.515);AC组[(179.43±59.19)μg/ml]与BM诱导组[(70.74±40.17)μg/ml]GAG含量差异有统计学意义(t=3.980,P=0.001),AC组[(185.13±35.96)ng/ml]与BM诱导组[(116.83±40.17)ng/ml]Ⅱ型胶原含量差异有统计学意义(t=3.434,P=0.003)。结论 BMSCs和ACs通过离心管内聚集共培养可诱导BMSCs分化为ACs,具有ACs的生物学特点。单纯AC组与1:3共培养组4周后HE染色下形成软骨组织雏形;BM诱导和2:2组未形成软骨组织雏形。

• 单位
  苏州大学附属儿童医院