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摘要
目的探讨低氧条件下B淋巴细胞瘤-2与腺病毒E1B 19 000相互作用蛋白3(BNIP3)对人真皮微血管内皮细胞(HDMEC)迁移的影响及机制。方法 (1)取HDMEC, 分成常规培养的常氧组及采用氧气体积分数为2%的低氧处理的响应时间点的低氧6、12、24 h组, 蛋白质印迹法检测细胞中BNIP3及微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)的蛋白表达。(2)取HDMEC, 分成常氧+空载组、常氧+BNIP3敲减组、低氧+空载组、低氧+ BNIP3敲减组, 分别转载空载病毒或BNIP3敲减病毒并进行常氧或低氧处理, 采用蛋白质印迹法和免疫荧光染色法检测BNIP3的蛋白表达;采用划痕试验检测划痕后24 h的划痕面积, 并计算创面愈合率, 在活细胞工作站测算细胞运动的曲线距离, 计算运动速度。(3)取HDMEC, 同实验(2)分组及处理, 蛋白质印迹法和免疫荧光染色法检测LC3Ⅱ的蛋白表达。对数据行单因素方差分析及LSD检验。结果 (1)与常氧组比较, 低氧处理6、12、24 h组细胞BNIP3及LC3Ⅱ的蛋白表达量显著增加(P<0.01)。(2)培养6 h, 常氧+空载组、常氧+BNIP3敲减组、低氧+空载组、低氧+ BNIP3敲减组HDMEC中BNIP3的蛋白表达量组间总体比较, 差异有统计学意义(F=37.88, P<0.01);与低氧+空载组比较, 低氧+ BNIP3敲减组中BNIP3的蛋白表达量显著下降(P<0.05)。常氧+空载组和常氧+BNIP3敲减组细胞中表示BNIP3表达的红色荧光较弱, 低氧+空载组细胞中红色荧光较低氧+ BNIP3敲减组明显增强。划痕后24 h, 低氧+空载组细胞划痕基本愈合, 其他3组细胞剩余划痕的面积较大。常氧+空载组、常氧+BNIP3敲减组、低氧+空载组、低氧+ BNIP3敲减组创面愈合率分别为(61±4)%、(58±4)%、(88.3±4.2)%、(57.4±3.9)%, 组间总体比较, 差异有统计学意义(F=14.57, P<0.001);低氧+空载组创面愈合率明显高于常氧+空载组(P < 0.001)和低氧+ BNIP3敲减组(P < 0.05)。观察3 h内, 低氧+空载组细胞运动范围较常氧+空载组显著增大, 低氧+BNIP3敲减组较低氧+空载组细胞运动范围明显缩小。常氧+空载组、常氧+BNIP3敲减组、低氧+空载组及低氧+ BNIP3敲减组细胞曲线运动速度组间总体比较, 差异有统计学意义(F=17.67, P<0.001);低氧+空载组细胞曲线运动速度较常氧+空载组和低氧+ BNIP3敲减组明显增加(P<0.001)。(3)培养6 h, 常氧+空载组、常氧+BNIP3敲减组、低氧+空载组、低氧+ BNIP3敲减组细胞LC3Ⅱ的蛋白表达量组间总体比较, 差异有统计学意义(F=37.88, P< 0.05);与低氧+空载组比较, 低氧+ BNIP3敲减组细胞BNIP3的蛋白表达量显著下降(P < 0.05)。培养6 h, 常氧+空载组和常氧+BNIP3敲减组细胞中表示LC3表达的红色荧光较弱, 低氧+空载组细胞红色荧光明显增强, 低氧+ BNIP3敲减组细胞红色荧光被显著抑制。结论低氧条件下BNIP3促进HDMEC的迁移和运动性, 且自噬可能参与BNIP3对HDMEC迁移和运动性的调节。
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