人骨骼肌成肌细胞体外分化的全程观察及INK4a信号通路对其衰老的诱导研究

作者：赵丽霞; 李蓉; 熊东林; 姚尚龙; 廖翔

来源：中华实验外科杂志, 2013, (07): 1383-1386.

• 骨骼肌成肌细胞
• 分化
• 衰老
• 信号通路

目的建立人骨骼肌成肌细胞分离和纯化方法,展示人成肌细胞体外增殖分化至衰老的全过程;研究INK4a信号通路对其衰老的诱导。方法采用机械法和胶原酶消化法,结合差速贴壁技术,获得高纯度的人成肌细胞,结蛋白(desmin)抗体染色鉴定,β-半乳糖苷酶染色及倒置显微镜下观察人成肌细胞生长、分化及衰老全程。构建慢病毒载体pLVX-p16~(INK4a),感染第3代人骨骼肌成肌细胞(p16组),采用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法测定p16~(INK4a)mRNA水平,Western blot法测定蛋白水平;用β-半乳糖苷酶染色及倒置显微镜下观察鉴定细胞衰老程度。结果 desmin抗体着色表明分离得到的人成肌细胞纯度接近100%,获取了其增殖并分化为肌管、肌纤维以及最终转归为衰老细胞各阶段的实验图片。转染7 d后,RT-qPCR法与Western blot法证明p16组细胞p16~(INK4a)mRNA与蛋白表达水平明显高于对照组(p<0.05);p16组细胞镜下见明显衰老表型,细胞计数显著少于对照组(P<0.05),胞质经β-半乳糖苷酶染色后有明显蓝染,而对照组胞质蓝染微弱。结论人成肌细胞体外分离培养获得的不同阶段实验图景与现象分析,为以其为靶点的研究奠定了基础。INK4a信号通路的上调直接诱导了人成肌细胞的衰老。

• 单位
  协和医院; 广东医学院附属南山医院; 华中科技大学; 中心实验室