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摘要
目的 观察富氢水对小鼠星形胶质细胞氧化应激损伤的保护作用及对磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的影响。方法 体外培养小鼠星形胶质细胞,取对数生长期细胞进行实验。①实验一：取部分细胞,用1.25、2.50、5.00、10.00 μmol/L过氧化氢(H2O2)作用细胞20 min,以确定H2O2诱导星形胶质细胞损伤所需的适宜浓度；用25、50、100、200 μmol/L富氢水分别培养3、6、9、12 h,以确定富氢水预处理的最佳浓度及时间；用50 μmol/L富氢水与PI3K/Akt信号通路抑制剂渥曼青霉素200 nmol/L或400 nmol/L共同培养,以确定渥曼青霉素最佳抑制浓度。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测星形胶质细胞存活率。②实验二：取部分细胞,按随机数字表法分为空白对照组、H2O2损伤组、富氢水预处理组(HW+H2O2组)、富氢水与渥曼青霉素共培养预处理组(HW+WM+H2O2组)。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测PI3K、Akt的mRNA表达,用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测PI3K、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白表达。结果 ①实验一：以空白对照组细胞存活率为100%。细胞存活率随H2O2浓度的增加而逐渐降低,2.50 μmol/L的H2O2作用20 min细胞存活率降至50%左右,故以此浓度建立细胞损伤模型。细胞存活率随富氢水预处理浓度升高、作用时间延长呈先升高后降低趋势,50 μmol/L富氢水预处理9 h时细胞存活率最高,故以此建立富氢水预保护模型。200 nmol/L或400 nmol/L渥曼青霉素与富氢水共同培养后,细胞活性得到抑制,200 nmol/L的渥曼青霉素干预后细胞存活率与H2O2损伤组差异无统计学意义,故以此建立星形胶质细胞抑制模型。②实验二：与空白对照组比较,H2O2损伤组PI3K、Akt的mRNA表达及PI3K、Akt、p-Akt的蛋白表达均明显降低。与H2O2损伤组比较,HW+H2O2组PI3K、Akt的mRNA表达及PI3K、Akt、p-Akt的蛋白表达均明显升高〔PI3K mRNA(2-ΔΔCT)：0.843±0.019比0.631±0.038,Akt mRNA(2-ΔΔCT)：0.591±0.025比0.558±0.037,PI3K/β-actin：1.277±0.008比0.757±0.004,Akt/β-actin：1.308±0.015比0.682±0.006,p-Akt/β-actin：1.210±0.005比0.614±0.005,均P<0.05〕。HW+WM+H2O2组PI3K、Akt的mRNA表达分别为0.784±0.159和0.556±0.037,PI3K、Akt、p-Akt的蛋白表达分别为0.715±0.006、0.686±0.005和0.606±0.004,均明显低于HW+H2O2组(均P<0.05),而与H2O2损伤组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。结论 富氢水通过激活PI3K/Akt信号通路介导小鼠星形胶质细胞而发挥抗氧化的生物学功能。
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