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摘要
为研究旋毛虫谷氨酸脱羧酶（GAD）基因在其谷氨酸依赖型抗酸系统2(AR2)中的作用，本研究根据GenBank中登录的旋毛虫GAD基因序列，设计3条靶向该基因的siRNA(GAD-siRNA1～GAD-siRNA3)及一条阴性对照NC siRNA。将这4条siRNA以2μmol/L的剂量通过浸染法分别转染旋毛虫肌幼虫（后均简写为肌幼虫），12 h后分别采用荧光定量PCR和western blot检测各siRNA的干扰效果；采用不同剂量的最佳siRNA按照上述方法转染确定最佳干扰剂量。结果显示，2μmol/L的GAD-siRNA1（后简写为siRNA1）对GAD基因的干扰效果最好。将2μmol/L siRNA1、NC siRNA分别在不同pH值的培养液中利用浸染法分别转染肌幼虫，培养不同时间后分别计算各组存活率；同时利用荧光定量PCR方法检测GAD基因的转录水平；采用比色法建立γ-氨基丁酸（GABA）的标准曲线，通过酶活性公式和标准曲线计算酸环境培养0.5 h后各组培养液中GAD的酶活性并测定其pH值。存活率结果显示，随培养时间的增加，同一pH值培养液中各组肌幼虫的存活率均降低，其中siRNA1组肌幼虫的存活率明显低于PBS和NC siRNA组（NC组）（P<0.05），其在pH2.5培养0.5 h时的存活率最低，各组肌幼虫在pH6.6培养0.5 h时的存活率均最高。荧光定量PCR结果显示，相同p H条件下，随培养时间的延长，siRNA1组肌幼虫GAD基因的转录水平均显著低于PBS和NC组。相同培养时间内，与两个对照组相比，随着培养液p H值的减小，siRNA1组肌幼虫GAD基因的转录水平均增加，且该组肌幼虫在pH2.5时GAD基因的转录水平显著高于pH6.6时的转录水平（P<0.05）。上述结果表明，酸性环境可以诱导旋毛虫肌幼虫GAD基因转录水平的升高。酶活性测定结果显示，相同pH条件下，siRNA1组肌幼虫培养液中GAD的酶活性均比PBS组和NC组低，且该组肌幼虫在pH2.5和pH4.0时GAD的酶活性显著高于pH6.6和pH8.0(P<0.05);p H值测定结果显示，siRNA1组肌幼虫培养液pH值相比其在不同pH条件下培养前均略升高，但差异不显著。上述结果表明，干扰GAD基因后会降低旋毛虫肌幼虫GAD的酶活性，且在酸性条件下该酶活性较高。将GAD基因干扰后的肌幼虫感染小鼠，感染后第7 d迫杀小鼠收集成虫，计算旋毛虫成虫减虫率，感染后42 d采用相同方法计算肌幼虫的减虫率、繁殖力指数（RCI）及每克肌幼虫数（LPG）；采集各组小鼠的膈肌，制作病理切片并经显微镜观察肌幼虫的保姆细胞。结果显示，siRNA1组成虫减虫率为31.50%，肌幼虫的减虫率为49.15%,RCI为62.51±7.32,LPG为1250.22±146.48。PBS组和NC组肌幼虫的RCI、LPG则显著高于siRNA1组（P<0.05）；小鼠膈肌病理切片观察可见，siRNA1组肌幼虫子代保姆细胞壁周围有大量炎性细胞，且保姆细胞裂解，而两个对照组肌幼虫子代保姆细胞壁周围无炎性细胞。表明干扰GAD基因后肌幼虫体内的抗酸能力降低，对宿主免疫系统的抵抗力减弱。本研究首次证实了旋毛虫谷氨酸依赖型抗酸机制在其抵抗酸环境过程中发挥的作用，为旋毛虫抗酸系统的全面研究奠定了基础，并为旋毛虫病的预防提供了新思路。
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