CASK基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

作者：覃觅; 孙宇; 刘俊; 王延宁; 赵文; 周华富

来源：广西医科大学学报, 2017, 34(05): 684-687.

DOI：10.16190/j.cnki.45-1211/r.2017.05.011

• CASK
• 慢病毒
• 载体构建
• 过表达

目的:构建人钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)基因过表达慢病毒载体并进行鉴定。方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增CASK基因片段,通过连接酶将CASK基因片段连接至线性化的GV358载体上,运用PCR方法鉴定阳性克隆的CASK-GV358载体;将重组质粒和包装质粒共转染至293T细胞,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)法进行滴度检测。将成功包装的CASK过表达慢病毒LV-CASK(OE组)和阴性对照病毒CON238(NC组)分别感染人非小细胞肺癌(NSCLC)H1299细胞,同时设空白对照组(MOCK组),用荧光定量PCR(FQ-PCR)和western blotting法检测CASK表达水平。结果:通过PCR技术成功地扩增CASK基因片段并连接到GV358病毒载体上,PCR及DNA测序鉴定结果证明CASK-GV358质粒构建正确;重组慢病毒转染293T细胞后可观察到绿色荧光及蛋白表达,包装过表达慢病毒并测定其浓缩滴度为2×108TU/mL。FQ-PCR和western blotting检测结果显示,与NC组相比,OE组CASK mRNA和蛋白的表达均显著上调(P<0.05)。结论:成功构建CASK基因过表达慢病毒载体,可在H1299细胞中稳定表达,为CASK基因的后期研究提供了实验基础。

• 单位
  广西医科大学; 梧州市人民医院; 广西医科大学第一附属医院