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摘要
目的探索建立稳定可靠的单细胞RT-PCR实验体系。方法以人β-actin和DPH2L基因为靶基因,通过各实验条件的比较优化,对单细胞RT-PCR扩增单个细胞中特异性目的基因和全细胞mRNA两种方法的扩增效果进行深入研究,并结合琼脂糖凝胶电泳和DNA测序技术,分析该方法的灵敏性、特异性、重复性和可靠性。结果单个细胞中的全部mRNA均得到了扩增,扩增成功率为75%,产物经核酸定量均可达到μg水平,足够常规分子生物学实验之用。β-actin和DPH2L基因均得到特异性扩增产物,未见基因组DNA污染,经BLAST比对为100%吻合,不同条件下扩增成功率在30%～90%之间。结论单细胞RT-PCR是一种行之有效的单细胞基因表达的研究工具,提高Mg~(2+)反应浓度并采用巢式引物有利于提高扩增成功率。
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单位中国人民解放军第二军医大学; 长海医院
